Exercices corriges
TD I et TD II. NB : Il est vivement conseillé de résoudre les différents exercices
avant de se .... Après électrophorèse en gel d'agarose, on obtient le profil n°1.
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Faculté des Sciences Semlalia
STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES
TD I et TD II
NB : Il est vivement conseillé de résoudre les différents exercices avant de se présenter en salle de TD. Les réponses données à la fin du document vous sont fournies pour vous permettre de vérifier la justesse de votre raisonnement. Faites un effort personnel avant de les consulter.
EXERCICE 1
Le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) est le coenzyme de nombreuses déshydrogénases.
A- Calculer labsorbance à 340 nm et à 260 nm d une solution de NADH à 0,05 g/litre, placée dans une cuve dont le trajet optique est de 1 cm.
PMNADH = 709 g/mol
µ NADH (à 340 nm) = 6 220 M-1cm-1
µ NADH (à 260 nm) = 15 400 M-1cm-1
B- Au cours d une manipulation, l expérimentateur réalise 5 ml dun mélange NADH/NAD+ mais oublie de noter les concentrations respectives sur le flacon. Pour trouver ces valeurs, il effectue des mesures au spectrophotomètre avec une cuve de 1 cm de trajet optique :
DO340nm = 0,44
DO260nm = 1,31
Quelles sont les concentrations en NADH et NAD+ dans le mélange sachant que :
µ NAD+ (à 340 nm) = 0 M-1cm-1
µ NAD+ (à 260 nm) = 15 400 M-1cm-1
EXERCICE 2
Au niveau d une cellule de mammifère, le poids moléculaire du DNA nucléaire natif est de 9.1011 daltons.
A- Quelle est la longueur en pb et en mètre de ce DNA associé en double hélice (forme B) ?
B- Lanalyse de la composition en base de ce DNA permet de déterminer le rapport A/G=4. Donner le pourcentage de chaque base pour ce DNA.
C- Connaissant la Tm du poly-d-AT (69,3°C) et du poly-d-CG (110°C), Quelle sera, dans les mêmes conditions expérimentales, La Tm de ce DNA ?
EXERCICE 3
A- Classer les molécules de DNA bicaténaire a, b et c par ordre croissant en fonction de leur température de fusion. Il sagit de molécules constituées de la répétition des séquences suivantes :
a) AAGTTCTCTGAA
b) GGACCTCTCAGG
c) AGTCGTCAATGC
EXERCICE 4
Les deux molécules A et B sont dénaturées et renaturées par chauffage puis refroidissement lent. Quelle est celle qui formera le plus souvent la molécule dorigine.
ATATATATATATATATATATATATATATATA
TATATATATATATATATATATATATATATAT
TAGCGGATGCTTCAATGCTATCCGTCAGCAT
ATCGCCTACGAAGTTACGATAGGCAGTCGTA
EXERCICE 5
On considère les DNA L, M et N. L et M ont une taille de 647 pb. L résiste aux exonucléases mais non M. Enfin, N est linéaire, mesure 0,3 ¼m et a un PM de 291 000 daltons.
A- Regrouper sur un tableau les diverses caractéristiques des DNA L, M et N : conformation (linéaire ou circulaire ; simple ou double brin, PM, longueur en ¼m et nombre de nucléotides.
B- On chauffe L et M et on mesure leur absorbance à 260 nm. On obtient lenregistrement ci-dessous. Expliquer la différence qui existe entre les deux profils à une température < 50°C. Interpréter les augmentations de la densité optique. Déterminer approximativement la Tm de L et M. En quoi diffèrent les DNA L et M ?
C- Une solution N1 du DNA N a une absorbance de 2,8 à 25°C. En mélangeant 2,5 ml de N1 à 7,5 ml deau, on obtient la solution N2. Tracer sur le graphe précédent la courbe correspondant à N2.
EXERCICE 6
Deux segments de DNA A et B ont la même taille (10 000 paires de bases) et contiennent chacun 1000 paires de bases (G+C).
Pour le segment A, les paires de bases (G+C) sont groupées au niveau de lune des deux extrémités du DNA. Pour B, elles sont réparties de façon homogène le long du segment de DNA.
Que donnera lanalyse de ces deux DNA : (Justifier votre réponse).
A- Par centrifugation isopycnique.
B- Par analyse de leur courbe de dénaturation ? Tracer les courbes en utilisant la relation : Tm=69,3+0,41(%G+C)
EXERCICE 7
A et B sont deux DNA de 6 kpb. Après électrophorèse en gel dagarose, on obtient le profil n°1. Si A et B sont préalablement soumis à laction de lendonucléase de restriction BamH I, le profil électrophorétique devient le profil n°2.
(Précision : une endonucléase de restriction est un enzyme qui opère une coupure spécifique sur le DNA double brin au niveau dune séquence bien déterminée)
A- Commenter ces résultats.
B- Donner le profil qui serait obtenu si on fait agir une exonucléase avant lélectrophorèse.
C- Donner le profil électrophorétique qui serait obtenu si on fait agir une autre endonucléase de restriction pour laquelle chacune des molécules (A et B) possède deux sites de coupure distants de 4000 pb.
EXERCICE 8
Dans le but de caractériser un acide nucléique inconnu, on réalise les expériences suivantes :
létude de la variation de labsorbance à 260 nm en fonction de la température entre 20°C et 90°C fait apparaître une brutale augmentation dabsorbance autour de 75°C suivie dune stabilisation. Leffet hyperchrome observé est de 30%. Si léchantillon est brutalement refroidi, labsorbance diminue peu.
Après centrifugation en gradient de CsCl, lacide nucléique natif conduit à lobtention dune seule bande correspondant à une densité de 1,77g/cm3 alors que léchantillon provenant de lexpérience précédente fournit lui aussi une seule bande mais de densité 1,72g/cm3.Par ailleurs, des mesures dabsorbance à 260 nm mettent en évidence que la bande de densité 1.72g/cm3 contient seulement la moitié du matériel présent dans la bande de densité 1.77g/cm3
Le contenu du tube de centrifugation contenant la bande de densité 1.72g/cm3 est remélangé longuement à une température de lordre de 60°C puis recentrifugé. On retrouve alors une seule bande de densité 1.77g/cm3 et contenant presque tout le matériel de départ.
La centrifugation en gradient de CsCl est maintenant réalisée sur un échantillon de lacide nucléique de départ placé en milieu alcalin (pH 12) pendant 1 heure puis ramené à pH7. On retrouve alors une bande de densité 1.72g/cm3 même si lon refait lexpérience (c) sur le contenu du tube.
Interpréter les résultats obtenus à lissue de chacune de ces expériences. Que peut-on dire de la structure de lacide nucléique natif?
EXERCICE 9
Un oligonucléotide subit une hydrolyse alcaline complète. Lhydrolysat contient :
2 Gp, 2 Cp, 3 Ap et 2 Up.
Loligonucléotide est traité par différentes nucléases :
La ribonucléase pancréatique conduit à un trinucléotide renfermant les bases A, C et G et 3 dinucléotides : lun contient G et U, lautre A et C et le troisième A et U.
Laction de la ribonucléase T1 libère Gp, un trinucléotide renfermant A, C et G et un pentanucléotide.
Après action dune 3-monophosphoestérase qui détache un groupe phosphate, loligonucléotide est mis en présence de la phosphodiestérase de venin de serpent pendant une courte durée : lhydrolysat contient de luridine-5-phosphate.
Après action de courte durée sur l oligonucléotide, la phosphodiestérase de la rate conduit à de la guanosine-3 -phosphate.
Donner la séquence en bases de l oligonucléotide.
ENZYMESPECIFICITE DE COUPURERibonucléase pancréatique (RNase A)5 ¬%¬%PYp!N¬%¬%3 RNase T15 ¬%¬%Gp!N¬%¬%3 3 -MonophosphoestéraseSuppression de l acide phosphorique du côté 3 Phosphodiestérase de venin de serpent3 exonucléasePhosphodiestérase de la rate5 exonucléase
EXERCICE 10
Une même quantité de DNA double brin d un virus est complètement hydrolysée par différentes enzymes de restriction utilisées seules (digestions simples) ou conjointement (digestions doubles). Après séparation par électrophorèse en gel dagarose, la taille des fragments générés est estimée (tableau ci dessous).
Etablir la carte des sites de restriction.
Enzymes utiliséesTailles des fragments en KpbBamH I
Hind III
Sal I
BamH I + Hind III
BamH I + Sal I
Hind III + Sal I6 et 12
6 et 12
2 et 16
6
2, 6 et 10
2, 4 et 12
EXERCICE 11
La structure primaire du DNA ?LMNOSm n v x y Ü Þ Ü
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