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Janvier 2002 - Inra

Cette approche multidisciplinaire semble essentielle pour permettre au sujet ...... fente orale et des gènes impliqués dans le métabolisme de xénobiotiques toxiques tels que les ...... Yang ZN, Davis GJ, Hurley TD, Stone CL, Li TK, Bosron WF.




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Août 2004 n°220
Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.
Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF
e-mail :  HYPERLINK "mailto:andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr" andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr

Concepts et Techniques
1. ### On sait que des mutations mitochondriales peuvent être associées à des pathologies diverses. Comme ces mutations sont héritées par la voie maternelle chez de nombreux animaux dont l'homme, on ne s'intéresse pas à celles qui affectent les fonctions de la lignée germinale mâle, car elles ne sont pas héritables, même si elles sont maintenues si elles ne sont pas trop désavantageuses pour les femelles.
NJ Gemmell et al.; Trends in Ecology & Evolution 19 (MAY04) 238-244 passent en revue comment de telles mutations peuvent, cependant, avoir un effet au niveau des populations.
La diversité mitochondriale intraspécifique, est une accumulation de mutations légèrement défavorables, probablement rarement fixées. Le taux de mutations est élevé du fait des stress oxydatifs permanents liés à la respiration associés à une réparation déficiente. Ces allèles mutés s'accumulent du fait que leur phénotype est globalement masqué au niveau des loci mutés dans chaque mitochondrie, empêchant ainsi la sélection d'intervenir.
Les mutations mitochondriales sont donc beaucoup plus sensibles à la dérive génétique (le tirage au sort des entités transmises dans une population réduite) qu'à une sélection quelconque.
En l'absence de recombinaison, le cliquet de Müller (Müller's ratchet) ne peut être évité que par des mutations réverses qui rétablissent plus ou moins la situation. Une petite population peut donc voir sa viabilité fortement réduite du fait de dysfonctions dans la fertilité mâle liée à des altérations de la phosphorylation oxydative. Ceci a été observé chez l'homme et chez la Drosophile où c'est plus une accumulation de mutations ponctuelles, sans significations individuelles précises, plutôt que des mutations spécifiques.
L'infertilité ne se révèle que quand le génome mitochondrial modifié devient l'haplotype dominant dans les gamètes de l'individu.
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2. ### Le fait de transcrire des séquences non codantes, et sans fonctions connues, doit avoir une signification qui est discutée dans S Schmitt et al.; Nature 429 (06JUN04) 510-511 dans un commentaire de l'article de JA Martens et al.; p.571–574. Les ARNs issus de cette transcription plus ou moins exhaustive du génome sont souvent considérés comme du "bruit" sans signification. Ces derniers auteurs montrent comment une transcription sans produit notable, à part un ARN sans signification, peut avoir une importance dans les régulations.
Ce n'est pas le produit, un ARN, messager ou autre, mais par la transcription elle-même qui permet une régulation.
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3. L'automixie ou parthénogenèse méiotique s'observe chez différents organismes. Elle consiste en une fusion des produits de la première division de la méiose rétablissant la diploïdie. Ceci entraîne, théoriquement, un maintien de l'hétérozygotie pour les gènes liés au centromère qui ont donc ségrégé lors de cette division. ME Hood et al.; Genetics 166 (APR04) 1751-1759 ont vérifié cette supposition chez divers isolats du champignon Microbotryum. Les auteurs ont constaté une plasticité considérable du génome (caryotype électrophorétique pour la taille des chromosomes) et un maintien notable de l'hétérozygotie (par AFLP). Les chromosomes sexuels se comportent d'ailleurs différemment des autosomes, de ce point de vue.
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5. Les centromères des Mammifères ne sont définis par aucune séquence ADN consensus, mais tous les centromères fonctionnels comportent la protéine CENP-A (CEntromere Protein A) qui n'est autre qu'une histone particulière. Cette dernière se substitue à l'histone H3 dans les nucléosomes centromériques et les tétramères subnucléosomique CENP-A et H4 sont plus compacts et plus rigides que les tétramères H3H4. Si on substitue, dans H3, le domaine de CENP-A responsable de la compaction, on obtient le ciblage vers le centromère avec le même effet. BE Black et al.; Nature 430 (29JUL04) 578-582.
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6. Les chromatides sœurs d'un chromosome sont "collées" ensemble par la cohésine après leur synthèse, lors de la réplication. A Lengronne et al.; Nature 430 (29JUL04) 573-578 montrent que le cohésine est surtout présente entre les gènes transcrits de façon convergente chez la levure, sans aucune séquence consensus, et c'est la transcription qui positionne les molécules de cohésine. Les sous unités de la cohésine commencent à se placer ailleurs, puis glissent vers leur position définitive. Ceci est également valable chez Schizosaccharomyces, ce qui suggère que c'est un mécanisme général.
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7. La fonction normale de la RNase P est de cliver les précurseurs des tRNAs. Des ribozymes construits à partir de la RNase P d'Escherichia coli sont en développement dans le groupe de F Liu à Berkeley et utilisés dans des stratégies antivirales (P Trang et al.; Methods Molecular Biology 252 (2004) 437-450, K Kim et al.; Nucleic Acids Research 32 (25JUN04) 3427-3434 et P Trang et al.; Cell Microbiology 6 (JUN04) 499-508) tout particulièrement dans le cas du cytomégalovirus.
H Zou et al.; Journal of Biological Chemistry 279 (30JUL04) 32063-32070 ont maintenant visé le messager de la thymidine kinase (TK) de l'herpes simplex virus 1 (HSV-1), et ont multiplié par 30 l'efficacité de la ribozyme (affinité pour le substrat et activité enzymatique) par rapport à celle d'origine en criblant des mutant aléatoires. Dans ce cas, deux mutations de l'ARN catalytique ont un effet notable, G95’!U améliore l'efficacité du clivage et A200’!C améliore l'affinité de la ribozyme pour l'ARN messager.
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8. Il serait intéressant de pouvoir déclencher, comme un poseur de bombes, l'expression d'un transgène grâce à une horloge programmée.
Des chercheurs du groupe de Fussenegger à Zürich ont monté une telle horloge en se limitant aux éléments régulateurs consensus positifs et négatifs de tous les pacemakers connus.
L'équipe a introduit les outils d'expression commandés par la tétracycline dans un vecteur lentiviral. D Chilov et al.; Biotechnology & Bioengineering 87 (20JUL04) 234-242.
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9. Les télomères des plantes, des unicellulaires eucaryotes et de la plupart des animaux sont constitués de répétitions en tandem copiées par la télomérase. La Drosophile est dotée d'un système différent où ce sont deux rétrotransposons sans longues répétitions terminales (non LTR) HeT-A de 6 kb (à ne pas confondre avec hET-A (human endothelin (ET) receptor A) et TART de 10kb (Telomere Associated RetroTransposon) qui les constituent et qu'on ne retrouve nulle part ailleurs dans les chromosomes.
La délétion des séquences télomériques chez Drosophila n'entraîne pas forcément une fusion bout à bout des chromosomes. Il existe donc des mécanismes complémentaires.
Chez les Mammifères, le gène ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) est activé par les dommages à l'ADN et intervient selon un mécanisme inconnu (en tout cas indépendant de la télomérase) pour réguler la longueur des télomères et les protéger. L'homologue de ce gène chez la Drosophile est le gène tefu (telomere fusion). En l'absence d'ATM, des fusions télomériques ont lieu même en présence des séquences de l'élément transposable Het-A spécifique des télomères (si j'ai bien compris, He signifie Heterochromatin et la séquence a été clonée dans le phage lð appelé T-A).
La perte d'ATM active l'apoptose à la suite des dommages à l'ADN. Cette perte réduit la quantité de la protéine télomérique HP1 (Heterochromatin Protein 1) au niveau des télomères, et ceci indique qu'ATM attire des protéines télomériques à l'extrémité des chromosomes. SR Oikemus et al.; Genes & Development 18 (15JUL04) 1850-1861.
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10. La longueur des télomères humains est régulée négativement par la fixation de TRF1 (Telomeric Repeat Binding Factor 1) à l'ADN double brin des télomères. TRF1 recrute alors POT1 (Protection Of Telomeres 1), une protéine se liant, elle, au simple brin dépassant des télomères, et inhibant la télomérase. On vient d'identifier un composant lié, la protéine PIP1 (POT1-interacting protein 1). PIP1 associée à POT1 et au facteur TIN2 (TRF1-INteracting factor 2) lierait POT1 au complexe TRF1. La dépression des niveaux de PIP1 ou POT1 entraîne une élongation des télomères. JZ Ye et al.; Genes & Development 18 (15JUL04) 1649-1654.
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Les Productions Végétales
Les gènes et les génomes
11. Des chercheurs indiens se sont livrés à la collection d'allèles de tolérance aux stress chez le riz japonica classique tempéré Nipponbare. Cela consiste à utiliser la séquence d'un allèle comme sonde pour "pêcher" d'autres allèles. R Latha et al.; Molecular Biotechnology 27 (JUN04) 101-108.
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12. Des chercheurs coréens ont construit une population de riz systématiquement marqués par l'élément transposable Ds du maïs, en partant de cals issus de grains porteurs de Ds et de l'élément actif Ac. CM Kim et al.; Plant Journal 39 (JUL04) 252-263. Dans la génération F2 des croisements entre les mêmes lignées Ac et Ds de départ, la plupart des lignées présentent des fréquences de transposition indépendante de l'ordre de 10-20%. De plus les éléments Ds subissent une immobilisation bienvenue dans ce genre d'études, même quand l'élément actif Ac reste présent.
L'analyse des séquences flanquantes de 1297 d'entre eux a permis d'établir une carte de 1072 sites d'insertions sur tous les chromosomes du riz avec, certes, une préférence pour le voisinage du site donneur, mais pas seulement. Les auteurs indiquent que 55% des Ds sont insérés dans des ORFs (Open-Reading Frames) c'est-à-dire des régions potentiellement transcrites.
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13. Des chercheurs de l'University of Tennessee se sont amusé à comparer 727 gènes et pseudogènes de cytochromes P450 des riz indica et japonica ainsi que d'Arabidopsis. DR Nelson et al.; Plant Physiology 135 (JUN04) 756-772. Les auteurs ont extraits 356 gènes de cytochromes P450 et 99 pseudogènes du riz et les ont comparé à 246 gènes et 26 pseudogènes de P450 d'Arabidopsis. La comparaison indique que la plupart de ces gènes sont antérieurs à la divergence mono- des dicotylédones, il y a quand même 200 millions d'années. On peut constater en comparant tous les génomes étudiés au sein du programme de phylogénie des plantes Deep Green qui s'est terminé en 2001, que certaines familles de ces cytochromes sont conservées comme les CYP80 chez les Ranunculales, ou ont été perdues, comme les CYP92 chez Arabidopsis au cours de l'évolution.
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14. Des chercheurs du Max Delbrück Laboratorium de Köln ont comparé les génomes d'Arabidopsis et d'une crucifère, Capsella rubella au sein d'une population dérivant d'un croisement entre Capsella grandiflora et C.rubella. La colinéarité est meilleure qu'entre Arabidopsis et différents Brassica. K Boivin et al.; Plant Physiology 135 (JUN04) 735-744.
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15. La synthèse des caroténoïdes chez les céréales et les Poacées en général a révélé quelques surprises. CE Gallagher et al.; Plant Physiology 135 (JUL04) 1776-1783. Le riz n'accumule aucun caroténoïde dans son albumen, contrairement au maïs, alors qu'il possède une voie de synthèse chloroplastique complète et fonctionnelle. Les gènes nucléaires de phytoène synthase ont été étudiés chez ces deux graminées. L'enzyme avait été associée avec le locus Y1 du maïs, et on pensait que c'était le seul locus fonctionnel sans qu'on ait pu caractériser son produit. En fait, maïs et riz possèdent deux exemplaires du gène avec PSY1 (Y1) et PSY2. La transcription de PSY1 est bien corrélée avec la production de caroténoïdes dans l'albumen. Les fonctions enzymatiques de PSY1 et PSY2 sont, par ailleurs, bien conservées. Les séquences sont semblables, sauf dans les domaines terminaux C- et N-terminaux. La duplication PSY se retrouve dans huit sous-familles des Poacées. Une duplication dans les gènes de synthèse des caroténoïdes a précédé la divergence des Poacées.
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L'Expression Génique
17. Le DNAbð est un ADN satellite circulaire simple-brin associé aux begomovirus monopartite (geminivirus à un seul segment génomique, DNA-A, mais associé au DNAbð), comme le Tomato yellow leaf curl China virus Y10 (TYLCCNV-Y10, maladie des feuilles jaunes en cuillère de la tomate). Le DNAbð de Y10 entraîne l'expression des symptômes, mais sa réplication et son encapsidation sont assurées par le DNA-A de TYLCCNV-Y10. Des chercheurs de Hangzhou (X Tao et al.; Plant Journal 39 (JUN04) 850-860) ont converti le DNAbð en un vecteur de "silencing" en remplaçant sa phase de lecture (ORF) C1 par un site de clonages multiples (MCS) permettant d'y insérer n'importe quelle courte séquence souhaitée pour le "silencing".Il est bien répliqué, mais perd sa capacité d'induire les symptômes.
On peut ainsi réprimer l'expression de n'importe quel gène de la plante. Ceci a été réalisé pour plusieurs gènes chez Nicotiana benthamiana.
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18. L'excision de bases endommagées ou mésappariées dans l'ADN est initiée par de petites glycosylases (200 à 300 acides aminés) qui coupent la liaison N-glycosidique entre le désoxyribose et la base. Un aspartate du site actif est impliqué dans cette réaction.
Le gène DEMETER (DME) d'Arabidopsis code une très grosse protéine de 1729 acides aminés qui possède un domaine ADN glycosylase de 200 aa. Il est exprimé essentiellement dans la cellule centrale du gamétophyte femelle, celle qui va donner l'albumen après la fécondation secondaire. DME active l'expression de l'allèle maternel du gène MEDEA (MEA) dans cette cellule, gène qui est donc un gène à empreinte parentale. Son activité est nécessaire à la viabilité de la graine. La substitution de l'aspartate 1304 en asparagine montre que ce domaine glycosylase, normalement associé avec une réparation de l'ADN, active également la transcription de gènes impliqués dans l'empreinte parentale.
On avait pu montrer que si les souris où l'homologue de ce type d'enzymes est muté sont sensibles à divers agents mutagènes, aucune anomalie développementale n'avait pu être constatée.
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Le développement
19. L'albumen issu de la fécondation secondaire, donne un syncytium avec une organisation progressive en un domaine antérieur et un domaine postérieur (l'embryon étant situé à l'avant de l'albumen. L'organisation du pôle postérieur implique la migration de noyaux dans le syncytium. Cette migration est handicapée chez les mutants des gènes de la famille FIS (FERTILIZATION INDEPENDENT SEED) que sont MEDEA (MEA), FIS2 et FIE (FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM).
Deux nouveaux loci de la voie FIS ont été caractérisés, MEDICIS et BORGIA. MEDICIS a été cloné et code l'homologue MULTICOPY SUPRESSOR OF IRA (MSI1) de la levure, une protéine à répétitions tryptophane-glycine. AE Guitton et al.; Development 131 (JUN04) 2971-2981.
Ce gène (ou, en tout cas, un gène du même type) avait été caractérisé par L Hennig et al.; Development 130, n°12 (JUN03) 2555-2565 comme étant requis pour un maintien épigénétique du développement reproducteur chez Arabidopsis. Sa surexpression ne se traduit par aucun phénotype particulier, mais son défaut bloque le développement floral après le basculement du stade végétatif au stade reproducteur.
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20. I Tzafrir et al.; Plant Physiology 135 (JUL04) 1206-1220 identifient une série de gènes indispensables au développement de l'embryon chez Arabidopsis.
Ils commencent avec un jeu de 250 gènes. (d'ici à ce que tous les gènes de la plante soient requis…). L'analyse de 34 de ces gènes confirmés, mais sans fonctions connues, montre que ce sont des gènes qui ne sont, effectivement, pas spécifiques de l'embryogenèse.
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21.### RGA (Repressor of ga1-3) et GAI (gibberellin insensitive) sont des régulateurs négatifs des réponses à la gibbérelline (GA) chez Arabidopsis. Le mutant GA-déficient ga1-3 ne germe pas, sa croissance est très limitée, et il est mâle-stérile. Les allèles nuls (produit non fonctionnel) rga et gai interagissent de façon synergique pour rétablir une croissance et une initiation florale normales chez le mutant ga1-3, ce qui indique que RGA et GAI sont des répresseurs majeurs de ces processus, mais pas de la germination qui ne peut être rétablie par ces allèles. RGA et GAI sont des protéines possédant un domaine caractéristique de 17 acides aminés appelé domaine DELLA. On en connaît trois autres chez Arabidopsis, RGL1, RGL2 et RGL3. L Tyler et al.; Plant Physiology 135 (JUN04) 1008-1019 montrent que les messagers de RGA et, dans une moindre mesure, de GAI, sont présents dans tous les tissus, tandis que les messagers de RGL1, 2 et 3 ne sont présents (et à haut niveau) que dans les graines en germination et dans les fleurs et fruits. Par ailleurs, les protéines DELLA freinant la croissance des plantes, la protéine SLY se lient spécifiquement aux protéines DELLA et plus particulièrement aux formes phosphorylées de ces protéines. X Fu et al.; Plant Cell 16 (JUN04) 1406-1418.
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22. L'information positionnelle chez les plantes peut être transmise entre cellules voisines par les plasmodesmes. On a pu montrer que c'est le cas pour certains facteurs de transcription comme SHORT ROOT (codé par SHR), qui est impliqué, chez Arabidopsis, dans la formation du patron radial de la racine.
Utilisant quatre promoteurs à spécificités tissulaires différentes et en repérant le site de l'expression d'un gène marqueur, G Sena et al.; Development 131 (JUN04) 2817-2826 montrent, après avoir vérifié que le système fonctionne pour des cellules où on sait que ces transferts ont lieu, que le transfert dépend du gène SCARECROW (SCR) dont le produit limite la diffusion du facteur de transcription. La réponse de spécification des lignées cellulaires est observée dans tout l'épiderme, alors que la stimulation des divisions ne l'est que dans les initiales et implique l'induction de SCR.
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23. Le développement asymétrique des deux faces d'une feuille (adaxial ou supérieur, et abaxial ou inférieure) est assuré par une partition du primordium selon cet axe. PHABULOSA (PHB), PHAVOLUTA (PHV) et REVOLUTA (REV) sont d'abord exprimés uniformément, puis cette expression se localise adaxialement après émergence du primordium. Des gènes de la famille KANADI et YABBY jouent en sens opposé dans la détermination initiale de cette asymétrie. Y Eshed et al.; Development 131, n°12 (JUN04) 2997-3006.
Un autre article, MT Juarez et al.; Nature 428 (04MAR04) 84-88 avait montré que ces deux gènes sont soumis à une régulation par un miRNA (miRNA166) qui a probablement une origine au dessous de la feuille et diffuse par le phloème.
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24. La forme de la feuille est déterminée par une expansion polarisée le long de l'axe de la feuille. Un mutant dominant d'Arabidopsis, rotundifolia4-1D (rot4-1D), possède de courtes feuilles et organes floraux. Ce gène code un petit peptide (non annotée dans le génome) qui freine les divisions cellulaires et, de ce fait, altère la morphologie des feuilles. Le peptide présente, une localisation membranaire. Ce gène appartient à une famille de 22 membres chez Arabidopsis, ROT FOUR LIKE1-22 (RTFL1-22). Les peptides correspondants portent un même domaine RTF de 29 aminoacides. La surexpression du domaine RTF de ROT4 est suffisante pour engendrer le phénotype rotundifolia. Des mutations de perte de fonction de ce gène sont aphénotypiques ce qui doit s'expliquer par une redondance. ROT4 est exprimé dans l'apex caulinaire et dans les jeunes feuilles, et il doit réguler la prolifération cellulaire dans les feuilles. NN Narita et al.; Plant Journal 39 (MAY04) 699-713.
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25. Des chercheurs de Shanghai (Y Qi et al.; Planta 219 (JUN04) 270-276) montrent que le gène ERECTA est nécessaire à la protection contre le stress thermique dans la voie AS1 et AS2 (ASYMMETRIC LEAVES) grâce à la manipulation de la polarité de la feuille. Ces deux gènes sont des régulateurs négatifs d'autres gènes à "homeobox" comme les gènes KANT.
Le gène AS1 code une protéine à domaine Myb (une structure se liant à l'ADN) d'Arabidopsis qui est l'homologue de PHANTASTICA (PHAN) d'Antirrhinum et ROUGH SHEATH2 (RS2) du maïs.
Des mutants sévères d'AS1 d'Arabidopsis donne des pétioles et des limbes foliaires de type Lotus dans le contexte génétique ERECTA. Les gènes de la famille PHAN doivent réguler l'élargissement du limbe foliaire et, de ce fait, le placement des folioles dans les feuilles composéees. S Kessler et al.; Current Opinion in Plant Biology 7 (FEB04) 65-72, (voir le Bulletin d'Avril-Mai §21). Ces feuilles lotiformes traduisent une perte de la polarité adaxiale/abaxiale.
Les mutants as1 et as2 ont un phénotype muté limité à la température préférée d'Arabidopsis de 22°C. La fréquence de ce phénotype augmente nettement, quand on élève la température au dessus, mais uniquement chez les plantes porteuses également de la mutation erecta.
Ce gène ERECTA d'Arabidopsis commande les communications inter-cellulaires permettant une prolifération cellulaire et une croissance normale des organes. Ses mutants présentent une stature réduite et une organisation compacte. Ce gène code un récepteur kinase. Les auteurs montrent donc que ce gène intervient également sur la polarité des feuilles en formation à température élevée.
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26. Les phénotypes narrow sheath (ns) du maïs correspondent à un défaut dans deux loci non liés ns1 et ns2. Les mutations récessives à chacun des loci entraînent la disparition du compartiment latéral des feuilles et homologues.
L'axe médiolatéral des feuilles du maïs comprend, en effet, deux compartiments dans lesquels NS assure un recrutement les cellules fondatrices des feuilles.
Les transcrits de ns sont détectables dans deux zones latérales du méristème caulinaire apical. Ceux de ns1 et ns2 s'accumulent en proportions équivalentes dans les méristèmes caulinaires apicaux tandis que les transcrits de ns2 prédominent dans les inflorescences femelles. J Nardmann et al.; Development 131 (JUN04) 2827-2839.
Le gène PRESSED FLOWER (PRS) intervient de façon claire dans le développement des sépales latéraux d'Arabidopsis, mais sans influence visible sur le phénotype foliaire. Leurs homologues chez le maïs sont ces allèles de ns1 et ns2.
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27. L'équipe de Meyerowitz a développé un système d'induction florale en cultures de tissus. D Wagner et al.; Plant Journal 39 (JUL04) 273-282. Il est basé sur la surexpression ectopique du facteur de transcription LEAFY (LFY) dans des cals. Lors de la régénération des tiges, ces dernières donnent directement des fleurs à partir des explants de racines sans formation des feuilles. Des structures foliaires sont converties en organes floraux. Des niveaux élevés de LFY permettent de court-circuiter le développement végétatif, avec une rapide stimulation de l'expression du gène cible de LFY, APETALA1 (AP1). Ceci devrait faciliter l'étude de la floraison. L'utilisation de réseaux d'expression a permis de révéler plusieurs autres gènes dont on ne savait pas qu'ils sont impliqués en aval dans cette voie de signalisation initie par LFY.
Il serait intéressant de reprendre les études sans suite de K Tran Thanh Van à Gif sur la floraison des orchidées à partir d'épidermes.
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La Reproduction
28. L'apomixie est un processus asexué qui permet de former des graines sans méiose et fécondation (voir, par exemple, la revue de AM Koltunov et U Grossniklaus; Annual Review of Plant Biology 54 (JUN03) 547-574). Ce mécanisme encore énigmatique permettrait, si on savait le maîtriser, d'amplifier immédiatement un individu femelle particulièrement intéressant (un hybride par exemple, pour conserver la vigueur hybride) chez des plantes où les croisements larges sont très difficiles et la distribuer sous forme de graines au lieu de racines stolons, tubercules etc…. Ainsi chez la pomme de terre, on utilise 10% de la récolte pour replanter. Les graines peuvent être obtenues, mais avec difficulté, en l'état actuel de la technique, et sont donc coûteuses.
L'apomixie est assez répandu chez les plantes, mais malheureusement pas chez les céréales, où elle serait très utile. On doit alors se rabattre sur la propagation végétative mais qui, chez les céréales, n'est pas disponible. Chez d'autres plantes cultivées à propagation végétative on a essayé une amplification par cultures in-vitro, ou par embryogenèse somatique. Mais, là encore, les coûts sont prohibitifs dans la plupart des cas.
Le groupe de Grossniklaus à Zürich reprend ce thème dans une revue C Spillane et al.; Nature Biotechnology 22 (JUN04) 687-691.
Il faut se rappeler que le marché des hybrides repose sur la constitution annuelle de grandes populations de F1 qui coûtent cher à établir. Une généralisation de l'apomixie permettrait d'économiser 2,5 milliards de dollars US par an. Les industriels seraient, de ce fait, relativement heureux de diminuer ces coûts, mais à condition que les cultivateurs ne puissent pas se saisir de cette facilité pour en faire des semences de ferme (le marché des semences certifiées représente un tiers du marché mondial de 50 milliards de dollars US, celui des semences de ferme, un autre tiers, le dernier étant couvert par des institutions publiques).
La revue commence par analyser les obstacles qui restent à tourner. Il existe deux façons de monter des plantes apomictiques, soit en introgressant des gènes d'apomixie de plantes voisines, mais dans le cas du maïs, on n'a jamais réussi à le faire (car on conserve des chromosomes additionnels et les graines avortent très fréquemment), soit en déréglant par ingénierie génétique, la reproduction sexuée.
Chez les céréales, l'albumen est essentiel pour l'homme, or chez le maïs sa formation dépend strictement du dosage de gènes paternels et maternels (2m:1p). Un maïs apomictique serait 4m:1p, provoquant l'avortement des grains. Les apomictes naturels n'ont probablement pas des exigences de ce type
La dérégulation de la reproduction sexuée par ingénierie génétique (mais aussi dans l'introgression) pourrait reposer sur des caractères apoméiotiques (non utilisation de la méiose) et parthénogénétiques (initiation de l'embryogenèse en l'absence de fécondation. Mais on doit, malheureusement, tenir compte des régulations épigénétiques. Il faudrait donc, au préalable, détecter des suppresseurs de ces régulations. On a identifié des promoteurs cellule- et stade-spécifiques. L'expression dans la cellule œuf des gènes BABY BOOM, WUSCHEL, LEAFY COTYLEDON1 ou -2 induisant l'embryogenèse somatique devrait permettre d'obtenir une parthénogenèse. L'expression de gènes considérés comme responsables de l'apomixie naturelle pourrait être une autre solution mais pour l'instant, aucun succès n'a été annoncé.
Les auteurs discutent également, des risques génétiques entrainés par la diffusion de ce caractère dans la nature, soit sous forme de plantes envahissantes soit par réduction de la variabilité naturelle. Il existe, malheureusement, des incohérences majeures entre les déductions de modèles génétiques et des données expérimentales qui indiquent une certaine ignorance de ces mécanismes. Il est fort probable qu'un faible taux de sexualité (et les apomictiques naturels sont toujours facultatifs) sème le chaos dans les déduction des analyses théoriques.
Il existe déjà des variétés apomictiques naturelles, et elles conservent une hétérozygotie permanente certes (contrairement aux plantes autogames), mais aussi à travers une sexualité épisodique. L'invasivité de certaines plantes est liée à cette hétérozygotie à la suite d'une hybridation, mais le seul cas où cette hétérozygotie a été stabilisée par apomixie est l'amélanchier (Amelanchier erecta) de nos régions méditerranéennes, et de nombreux fourrages apomictiques sont cultivés depuis des années.
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La Physiologie des Plantes
29. Les bois de feuillus possèdent une couche gélatineuse additionnelle (couche G) dans les parois secondaires (après la fin de la croissance cellulaire du xylème) des bois de tension. On ne sait pas trop bien si cette couche contient de la lignine. Des chercheurs de Grenoble ont analysé ce type de bois chez le peuplier (Populus deltoides). Ils révèlent une abondance d'unités syringyle dans la couche G. Ces unités ne sont pas condensées et dispersées dans la matrice cellulosique caractéristique de cette couche.
Le dépôt de structure syringyles a lieu dans la phase tardive de la formation de la paroi secondaire de la couche G. JP Joseleau et al.; Planta 219 (JUN04) 338-345.
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30. Les différents phytochromes (phy) d'Arabidopsis (phyA à phyE) ont des spectres de réponse différents lors de la croissance et de la différenciation de la plante. PhyB est sensible à la lumière rouge. PhyA est le seul phytochrome sensible au rouge lointain. L'équipe de Quail a utilisé des mutants nuls de phyB et phyA ainsi que des versions normales et comparé les profils d'expression pour démêler les fonctions des autres phytochromes sensibles au rouge. JM Tepperman et al.; Plant Journal 39 (JUN04) 725-739.
Leurs résultats indiquent une convergence assez rapide des deux voies activées par le rouge et le rouge lointain activant l'expression de mêmes gènes. Or les mutants de phyB stimulent quand même un grand nombre des gènes supposés répondre au rouge. Il semble que plusieurs gènes Phy se partagent l'activation des gènes répondant au rouge suivant les différents organes.
PhyB est le phytochrome dominant, mais pas exclusif dans ce domaine, stimulant une partie seulement des gènes répondant au rouge impliqués dans la suppression de l'élongation de l'hypocotyle. Cette fonction sensorielle est partagée avec d'autres phytochromes commandant l'essentiel de la réponse au rouge par désétiolement dans la région apicale comme l'expansion des cotylédons.
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32. Utilisant un promoteur répondant aux stress (RD29A) et un gène marqueur, J Zhu et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (29JUN04) 9873-9878 ont exploré quels étaient les gènes d'Arabidopsis répondant à divers stress. Ils ont caractérisé un gène par un mutant, hos9-1 (high expression of osmotically responsive genes), où la réponse est stimulée par le froid, mais pas par l'acide abscissique ou le sel. Les mutants poussent plus lentement, fleurissent plus tard et sont plus sensibles à la gelée (avant et après acclimatation au froid) que les plants normaux.
Le gène HOS9 code un facteur de transcription à homéodomaine. HOS9 est exprimé en permanence et un choc hypothermique ne modifie pas son expression. Le CBF (C repeat/dehydration (CCGAC) responsive element Binding Factor) qui assure l'acclimatation au froid chez Arabidopsis n'est pas impliqué.
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33. La saccharose-phosphate synthase (SPS) est une enzyme importante dans la production du saccharose. Il existe trois familles de SPS chez les dicotylédones : A, B et C. On vient de montrer qu'il en existe cinq chez le blé (Triticum aestivum) et d'autres Poacées. CK Castleden et al.; Plant Physiology 135 (JUL04) 1753-1764.
Trois d'entre elles sont les homologues des familles A,B et C, mais les deux familles additionnelles font partie d'un nouveau type, D qui est apparu après la divergence mono/dicotylédones et a subi une duplications ultérieure. Les SDS de type D ne présentent pas le site de phosphorylation lui permettant de se lier à d'autres protéines et d'être activées sous stress osmotique. Chacune des familles du blé démontre des patrons d'expression, certes recouvrants, mais distincts spatialement et temporellement. Chaque organe exprime au moins deux de gènes différents.
On trouve, chez le riz, un antisens de gène SDS qui expliquerait le faible niveau d'expression de SPS11 chez cette plante.
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34. Des mutants dominants du gène ADR1 (Activated Disease Resistance 1) confèrent une résistance à large spectre et code une protéine à domaine sérine/thréonine kinase de type CC-NBS-LRR (Coiled-Coil-Nucleotide-Binding Site-Leucine-Rich Repeat) provoquant la synthèse des PR1, c'est à dire de réponse à des pathogènes. Ce gène code donc un inhibiteur des réponses (voir JJ Grant et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 16 (AUG03) 669-680). Le même groupe vient de montrer que ces mutants ont une résistance à la sécheresse et à la chaleur exacerbée. A Chini et al.; Plant Journal 39 (JUN04) 810-822.
Ce mécanisme doit être un peu particulier car (DRE)B2A, mais pas DREB1A (Dehydration-Responsive Element) répondent aux stress chez ces mutants, ainsi que RD29A et RD22 (Response to Dehydration). L'expression de DREB2A est salicylate dépendante, mais NPR1-indépendante (Non-expressor of PR genes). Les gènes EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility) et ABI1 (ABscissic acid Insensitive) participent à cette tolérance. Il y a donc convergence des voies de résistance aux stress biotiques et abiotiques.
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35. Les tocophérols (vitamine E) sont supposés protéger les membranes chloroplastiques et l'appareil photosynthétiques des dommages photooxydatifs. Il doit exister des différences entre les plantes en C3 et C4, notamment dans ces fonctions anti-oxydantes. D Hofius et al.; Plant Physiology 135 (JUL04) 1256-1268.
Le mutant sxd1 (suc export defective1) du maïs possède une tocophérol cyclase chloroplastique déficiente, et il est dépourvu de tocophérols. Le mutant vte1 (vitamin E deficient1) homologue d'Arabidopsis n'a pas le même phénotype que sxd1. Le groupe d'U Sonnewald a caractérisé l'homologue de la pomme de terre (orthologue), StSXD1. Il a ensuite inactivé l'expression par interférence ARN (RNAi).
La quasi-absence de tocophérols cause une absence d'exportation des photoassimilats, comme dans le cas des mutants sxd1, absence apparemment due aux dépôts de callose vasculaires dans les feuilles sources. Il en résulte un excès de saccharose dans celles-ci, ce qui suggère une régulation en retour, plutôt qu'un impact direct de l'absence de tocophérols sur la photosynthèse.
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36. Une inhibition par antisens a été utilisée pour inhiber l'isoforme chloroplastique de la fructose 1,6-bisphosphatase de la tomate avec le cDNA de l'enzyme homologue de la pomme de terre. H Obiadalla-Ali et al.; Planta 219 (JUL04) 533-540. Les fruits des tomates transgéniques sont alors plus petits. Les teneurs en glucose et fructose sont accrues dans les fruits verts (meilleurs pour la salade, croyez moi), mais sans modifications aux stades tardifs de la maturation. La teneur en saccharose n'est guère modifiée
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Les Symbioses
38. ### BJ Henson et al.; Journal of Molecular Evolution 58 (APR04) 390-399 retracent l'évolution de la fixation de l'azote sous un autre aspect. Ils analysent la structure du gène NifD codant un des éléments du complexe de la nitrogénase, ce dernier étant codé par l'opéron nifHDK. La dinitrogénase (une protéine à molybdène et fer) est un tétramère avec deux sous-unités codées par nifD et deux sous-unités codées par nifK. Les auteurs ont utilisé ce gène pour déterminer l'origine évolutive de la fixation de l'azote.
Le problème évolutif est que cette capacité est distribuée de façon aléatoire dans des groupes bactériens très distants, et même des Archées. On s'est beaucoup disputé sur le sujet, car on trouve presque autant d'arguments pour une transmission verticale avec évolution dans la même espèce que pour une transmission horizontale, suivant le gène étudié.
La première discussion porte sur la place systématique des différents acteurs, cyanobactéries, protéobactéries, actinobactéries et firmicutes (les Gram+) et leur caractère monophylétique ou pas. Ainsi les cyanobactéries et les actinobactéries sont parfois placées parmi les protéobactéries. Or ceci est incompatible avec les données des séquences classiques ribosomiques, ce qui indique un transfert horizontal. D'autres analyses indiquent une transmission verticale avec une monophylie des cyanobactéries, protéobactéries et Gram+. Un des pièges dans ces études est la comparaison, non pas des gènes fonctionnels, mais de gènes paralogues issus de duplication et ayant peut être divergé sur le plan fonctionnel.
L'arbre phylogénique le plus parcimonieux.(que c'est laid) et la méthode de vraisemblance maximum appliqués aux séquences protéiques, et la
vraisemblance maximum aux séquences nucléiques confortent l'hypothèse d'une monophylie des cyanobactéries et des actinobactéries mais pas des protéobactéries, indiquant une transmission verticale. Les distances des séquences nucléiques regroupent les actinobactéries avec les protéobactéries, ce qui indique une transmission horizontale. Le mystère reste donc entier et cela est discuté par les auteurs.
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39. Une revue sur l'invasion des racines par les Rhizobium fixant l'azote atmosphérique est parue avec DJ Gage; Microbiology & Molecular Biology Reviews 68 (JUN04) 280-300. L'auteur s'intéresse surtout aux nodules indéterminés (à croissance continue grâce à un méristème persistant), dont Medicago truncatula est un modèle de plus en plus utilisé. Un tour d'horizon initial porte sur les différentes symbioses microbiennes fixatrices de l'azote chez les plantes ouvre la revue. Après une brève description du processus d'infection et de la formation des poils racinaires, la revue s'attaque aux phases initiales de l'infection, en posant, notamment, la question de savoir s'il existe un signal déclenché par les facteurs Nod spécifiques de l'initiation. La progression des cordons infectieux, avec les contributions respectives de la plante et de la bactérie, en particulier la prolifération des bactéries dans le cordon. L'induction de la réponse du péricycle et du cortex racinaire est analysée. La fin de la revue porte sur les réponses de défense de la plante avec le rôle de l'éthylène dans la régulation de l'infection et de la nodulation.
Sur le plan écologique, on se demande encore quel est le bénéfice pour la bactérie, ce qui explique le très court paragraphe sur le sujet.
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Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense
40. Arabis mosaic virus est un népovirus qui s'attaque aussi à la vigne. Il est transmis principalement par le nématode Xiphinema diversicaudatum. C'est un des trois agents du court-noué de la vigne avec les Grapevine fanleaf virus (GFLV) et le Raspberry ringspot virus.
Les Nepovirus possèdent deux ARNs simples brins directement traductible, RNA 1 et RNA 2, polyadénylés à leur extrémité 3' et sur lesquels est greffée à l'autre extrémité (5') une petite protéine (VPg). L'ARN1 est traduit en polyprotéines clivées par la protéaser à cystéine 1Dpro protéase en 1A, 1B, 1CVPg (VPg), 1Dpro (protéase) et 1Epol (polymerase) et trois produits par ARN2: 2A (réplication de l'ARN2), 2BMP (protéine mobilisatrice) et 2CCP (protéine de capside). On connaissait la séquence de l'ARN2. La séquence complète de l'ARN1 d'un variant isolé sur la route des vins allemande (à Neustadt an der Weinstrasse) vient d'être établie. Elle comporte une identité à 75% avec la souche F13 de Grapevine fanleaf virus qui comporte un ARN satellite supplémentaire, comme l'avait montré l'ARN2
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41. Les pathogènes microbiens des plantes sont contrés par une immunité dépendant de l'acide salicylique (SA). Certains de ces pathogènes inactivent ces défenses. C'est le cas de Pseudomonas syringae (avec la mutation DðCEL pour conserved effector loci), Erwinia amylovora (avec la mutation dspA/E ce sont deux dénominations pour un seul gène) et Pantoea stewartii subsp. stewartii (avec la mutation wtsE) qui montrent une virulence fortement atténuée. S DebRoy et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (29JUN04) 9927-9932 montrent que la perte de la virulence chez les mutants DðCEL et dspA/E est liée à leur incapacité à annihiler les défenses pariétales d'Arabidopsis et du pommier.
Le mutant DðCEL est incapable d'empêcher la synthèse de callose sous l'effet de l'acide salicylique. Ce mutant se multiplie, d'ailleurs, plus efficacement dans les plantes SA-déficientes que les normales.
La conservation des effecteurs codés par HopPtoM et AvrE (homologue de dspA/E) chez plusieurs bactéries et injectés par un système sécrétoire de type III, souligne leur rôle probable dans la neutralisation des défenses, notamment associées au dépôt de callose. Le produit de hopPtoM (CEL ORF3), est important pour la formation des lésions, mais pas pour la prolifération de la bactérie chez la tomate.
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42. La fusicoccine (FC) qui est un activateur de l'ATPase à protons de la membrane plasmique déclenche plusieurs mécanismes de défense chez les plantes, avec la synthèse d'hormones et des protéines PR (Pathogenesis Related). Cette réponse a été analysée chez la tomate par J Singh et al.; Planta 219 (JUN04) 261-269. La production des PRs n'exige, en réalité, pas l'intervention des diverses hormones normalement impliquées dans les défenses ni, d'ailleurs, les oxygènes réactifs et les ions Ca++. En fait, la FC accroît les lésions de façon éthylène-dépendante.
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43. Les virus de la mosaïque du manioc (CMD) menacent les récoltes dans de nombreux pays sub-tropicaux où cette culture est importante. Elle est causée par une famille de huit geminivirus (virus bipartite à ADN) transmis par des aleurodes.
L'équipe de Fauquet au Danforth Plant Science Center montre que la récupération après une infection virale de Nicotiana benthamiana et du manioc par cinq des geminivirus (un isolat camerounais (ACMV-[CM]) de l'African cassava mosaic virus), East African cassava mosaic Cameroon virus (EACMCV), East African cassava mosaic virus (EACMV-[UG] de l'Ouganda), Sri Lankan cassava mosaic virus et l'Indian cassava mosaic virus (ICMV) est liée à l'activité de siRNAs qui bloquent l'infection virale.
Dans le cas de l'isolat camerounais de la mosaïque africaine du manioc ACMV-[CM], le PTGS porte sur l'inhibition de séquences correspondant à la phase précoce de l'infection, avec AC1 codant la protéine de réplication Rep, et AC2 codant l'activateur de transcription TrAP], la partie aval d'AC1 recouvre la partie amont d'AC2, tandis que c'est la partie aval du gène tardif codé par le DNA-B du génome bipartite de l'East African cassava mosaic Cameroon virus. Il existe donc probablement une étape ARN double-brin dans la réplication de ces virus à ADN simple-brin.
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44. La répression de l'expression génique induite par les virus ou VIGS (Virus-Induced Gene Silencing) consiste en une dégradation spécifique des messagers cellulaires, utilisable pour moduler artificiellement l'expression de gènes chez les plantes.
Des virus à ARN comme à ADN ont pu être utilisés, mais ils diffèrent dans leur localisation cellulaire et dans leur mode de réplication. Des chercheurs associés à Vaucheret de l'INRA à Versailles ont utilisé un vecteur dérivé du cabbage leaf curl virus (CaLCuV), un geminivirus (donc à ADN) qui réprime l'expression de chlorata 42 exigé pour la formation de la chlorophylle, pour analyser le "silencing". Ce vecteur a été exprimé dans des mutants du silencing (suppressor of gene silencing) sgs1, sgs2, sgs3 et ago1 (argonaute1) défectifs dans le "silencing" post-transcriptionnel "sens" induit par les transgènes (S-PTGS).
SGS2/SDE1 (une ARN-dépendent RNA polymérase potentielle ainsi que SGS3 sont nécessaires à la répression des virus à ADN et la surexpression de SGS2/SDE1 pourrait réduire les symptômes des geminivirus. N Muangsan et al.; Plant Journal 39 (JUN04) 1004-1014.
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45. L'expression dans des plantes transgéniques d'anticorps monocaténaires regroupant les parties variables des chaînes lourdes et légères (ScFvs) dirigés contre les domaines conservés de l'ARN polymérase ARN-dépendante de plusieurs Tombusvirus (prototype Tomato Bushy Stunt Virus ou virus du rabougrissement de la tomate) permet d'inhiber la réplication des virus correspondants et même du virus de l'hépatite C. KJ Boonrod et al.; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 856-862.
Les motifs conservés sont portés par une partie de la protéine de fusion dérivant d'un franchissement de codon stop ambre du gène de la polymérase p33 et donnant la protéine p92.
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46. Deux précautions valent mieux qu'une, D Peschen et al.; Nature Biotechnology 22 (JUN04) 732-738, ont fusionné un anticorps spécifique de Fusarium avec des peptides antifongiques pour protéger efficacement Arabidopsis thaliana contre Fusarium oxysporum f.sp. matthiolae, alors que les deux défenses ont une efficacité séparée relative, en différant seulement les symptômes (ce qui est souvent le cas des peptides naturels antifongiques).
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Les plantes recombinantes
48. Les composés phénoliques sont considérés comme des antioxydants alimentaires souhaitables. L'acide chlorogénique (CGA ou acide 3-O-caféoylquinique) s'accumule particulièrement chez certaines plantes, comme dans le grain de café (pour lequel une abondante littérature existe) et les feuilles d'artichaut, ainsi que dans les soies de maïs et certaines solanacées (tomate, pomme de terre et aubergine), pommes poires et prunes. Le CGA est facilement absorbé dans l'intestin grêle mais, dans le colon l'essentiel de la caféine du CGA est clivée (voir MP Gonthier et al.; Journal of Nutrition 133 (JUN03) 1853-1859).
La caféine semble avoir les mêmes propriétés anti-oxydantes. Mais les propriétés antidiabétiques du CGA se transforment en prodiabétiques après clivage de la caféine qui est responsable de ce dernier effet.
Des cDNAs de la hydroxycinnamoyl-CoA quinate: hydroxycinnamoyl transférase (HQT), ont été caractérisés chez la tomate et le tabac où cette enzyme est nécessaire à cette synthèse. Sa surexpression chez la tomate pourrait en faire un bon additif pour l'alimentation humaine. R Niggeweg et al.; Nature Biotechnology 22 (JUN04) 746-754
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49. On trouvera dans N Huang; BioProcess International (JAN04) 54-59 de Ventria Bioscience, une revue sur l'optimisation de la production de protéines hétérologues chez les plantes. Cette revue porte surtout sur son système ExpressTec"! utilisant une licence de la technique PureIntro"! de Japan Tobacco (www.ventria.com) et développé depuis 1997 chez le riz et l'orge. Il se vante d'arriver à 1% du poids du grain dans ces plantes.
Un grain de riz peut donner, grâce au tallage, plus de 10 000 grains ce qui est un facteur d'amplification raisonnable. La plante est, comme le blé et l'orge, autogame à 99%. Le pollen a une durée de vie très courte (cinq minutes après sa libération), deux caractéristiques limitant une dispersion intempestive (mais on a souvent des surprises sur ce plan).
Les protéines de réserve du riz constituent 8% du grain et comprennent plus de 80% de glutélines, 10% de globuline, moins de 5% de prolamines et des albumines (5%). Elles sont, pour la plupart codées par de grandes familles de gènes (une vingtaine pour les glutelines, mais un seul pour la globuline). L'expression de ces gènes commence cinq jours après la fécondation atteint un pic de 20–30 jours suivant la variété et les conditions climatiques. Le sort des protéines après traduction est un peu variable. Ainsi les prolamines sont retenues dans le reticulum et donne des corps protéiques par bourgeonnement de la membrane du reticulum tandis que glutelines et globulines sont déposées dans des corps protéiques différents.
Dans le reticulum, les protéines sont ornées d'une chaîne de 10 mannoses dans le cadre d'une N-glycosylation classique sur le groupement NH2 d'une asparagine.
Certains des mannoses sont ultérieurement excisés et remplacés par du xylose, du fucose ou du glucose, ce qui peut poser des problèmes. Aucune sialylation de type humain n'est détectable. La tolérance humaine à ces glycosylations, ainsi que l'activité des protéines ainsi ornées dépend des protéines. Comme notre intestin est constamment exposé à ce type de glucanes, il n'y a probablement pas de problèmes pour une administratuion orale, mais des injections répétées pourraient poser problèmes.
La firme a placé le gène du lysozyme humain (voir J Huang et al.; Molecular Breeding 10 (SEP02) 83-94) sous la commande de six promoteurs différents de gènes de protéines de réserve et a fait commander par ces promoteurs le gène du lysozyme humain. Le promoteur du gène Gt1 (gluteline 1) parait le plus efficace (4,5% à 40% des protéines solubles) avec, en second, celui de la globuline (3% à 23%).
Le système d'expression ExpressTec"! combine ce promoteur (ciblant la production uniquement dans le grain) à une séquence signal de ciblage pour éviter la protéolyse dans le cytosol, et une optimisation des codons et (si le peptide souhaité est court) une fusion. L'auteur montre que le succès dépend un peu de la plante choisie, comme illustré par la lactoferrine humaine. La firme de l'auteur affirme qu'elle produit 400 fois plus dans le riz que dans le tabac, avec 1% du poids du grain ou 40% du total des protéines solubles. Comme on peut récolter 7,2 à 8 tonnes de riz par hectare en Californie, ceci donnerait une production de lysozyme de 70 à 80 kg par hectare. L'expression reste stable sur six générations, au moins, et la protéine pendant deux and et demi dans le graine. La stabilité de la protéine dans l'albumen est compréhensible car c'est, ici, un tissu mort. L'activité des protéines est, selon l'auteur, la même que celle de la protéine d'origine.
Ventria Bioscience produit également un lignane, le matairésinol, avec des propriétés supposées de prévention de mauvaises choses pour notre santé. Quatre gènes impliqués dans la synthèse ont été exprimés.
L'extraction se fait par une solution saline. La firme a purifié à 90% la lactoferrine sur Sepharose avec un rendement de 50%.
Le prix courant du riz paddy ordinaire sur le marché mondial est de l'ordre de 120 $ US la tonne métrique (aux Etats-Unis il est de 207$ la tonne). Il faut y ajouter le coût du traitement soigneux nécessité par la production du substances pharmaceutiques qui devrait tripler ce prix. Si on prend en compte une production à hauteur de 0,5% de protéine dans le grain, le prix de revient de la protéine serait de 155$ le kg aux conditions de la Californie.
L'intensité de la purification dépend de l'usage prévu. Pour un usage alimentaire de la lactoferrine il reviendrait à 1$US par kg de farine et de 5 à 10$ le gramme pour un usage pharmaceutique. L'auteur ne mentionne pas les difficultés éviquées au §158 du Bulletin de Juin pour faire accepter ces cultures par les voisins.
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50. La production d'acides gras polyinsaturés à longues chaînes (LCPUFAs) comme les acides arachidonique (C20:4), eicosapentaènoïque (C20:5) et docosahexaenoïque (C22:6) est possible dans les plantes. Une revue de AG Green; Nature Biotechnology 22 (JUN04) 680-682, s'appuyant sur l'article de B Qi et al.; p.739-745, examine les possibilités offertes.
On sait que ces acides gras dits essentiels, sont exclusivement d'origine marine dans notre alimentation et on ne peut compter encore longtemps sur cette ressource.
Les formes wð3 et wð6 des LCPUFAs sont des précurseurs de différentes familles de prostaglandines. Les LC-wð3-PUFAs, comme les acides eicosapentaenoïque et docosahexaenoïque ont également un rôle structural au cours du développement. fStal et néonatal.
Les plus importants des LC-wð3-PUFAs, les acides eicosapentaenoïque et docosahexaenoïque peuvent être synthétisés par notre corps à partir du précurseur alimentaire commun, l'acide að-linolénique (C18:3), mais avec une efficacité détestable, particulièrement en présence d'acide linoléique (C18:2) et de wð6-PUFA entrant en compétition avec le même précurseur, l'acide að-linolénique, dans l'élongation et la désaturation nécesaire à la synthèse des acides eicosapentaenoïque et docosahexaenoïque. C'est pourquoi on fait appel aux huiles de poissons marins. Mais ceux-ci sont inaccessibles pour certains, surexploités pour les autres et peuvent être contaminés par du mercure.
Des exploitations de microalgues capables de les fournir commercialement existent, mais sont économiquement très fragiles.
Toutes les plantes "supérieures" produisent les acides linoléique et að-linolénique, parfois de l'acide stéaridonique (C18:4), mais aucune n'est capable d'aller au delà en longueur et en désaturation de la chaîne, pour donner les acides arachidonique, eicosapentaenoïque et docosahexaenoïque. Il faut donc introduire des enzymes additionnelles.
Il existe plusieurs voies de conversion à partir des précurseurs C18-PUFA. La voie aérobie classique ou voie "Dð6"ð ð" est celle de la plupart des eucaryotes synthétisant des LCPUFA. Elle commence par une désaturation en Dð6, un cycle d'élongation et une Dð5-désaturation, qui donne l'acide arachidonique quand l'acide að-linoléique est le substrat initial et de l'acide eicosapentaenoïque quand l'acide að-linolénique est le substrat initial.
Il existe, cependant, chez une "algue" unicellulaire comme Euglena gracilis, une autre voie qui commence par allonger la chaîne, puis effectue deux désaturations successives en Dð8 et Dð5. (voie Dð8)
Il existe également des alternatives pour passer de l'acide eicosapentaenoïque au docosahexaenoïque. La voie "Dð6" consiste en une élongation de l'acide eicosapentaenoïque en docosopentaenoïque (C22:5) suivi par une Dð4-désaturation. La voie humaine, peu efficace, consiste en deux élongations successives de l'acide eicosapentaenoïque suivie par une Dð6-désaturation, mais suivie par un cycle de bð-oxydation qui raccourcit la chaîne de deux carbones pour donner l'acide docosahexaenoïque.
Certaines bactéries marines et les thraustochytrides (des protistes fungoïdes, dénommés également Labyrinthulomycètes, et par ailleurs mal connus) sont capables de synthétiser les acides eicosapentaenoïque et docosahexaenoïquede façon anaérobie par une voie entiérement différente, du type polycétide. Deux produits sont actuellement commercialisés à partir d'un Schizochytrium qui est donné à manger à un rotifère (Brachionus), ou à la classique Artemia salina, qui sont ensuite incorporés dans les aliments pour aquaculture.
Tout ceci suggère qu'on dispose d'assez de possibilités. Plusieurs tentatives ont déjà eu lieu pour assembler la voie Dð6 , mais avec un succès limité, probablement du fait du transfert très limité du PUFA en C18 Dð6-désaturé de leur substrat phosphatidylcholine vers le pool d'acyl-coenzyme A où a lieu l'élongation suivante.
B Qi et al. ont transplanté la voie alternative Dð8, avec ses deux désaturations successives indique que les différentes voies ont des efficacités très différentes. Ils ont exprimé le gène de la Dð9-PUFA élongase de la microalgue Isochrysis galbana, ðcelui de la ðDð5-désaturase de Mortierella alpina et une gène de Dð8-désaturase d'Euglena gracilis, le tout commandé par le promoteur 35S. Les Arabidopsis transformées contiennent 7% d'acide arachidonique et 3% d'acide eicosapentaenoïque dans les tissus foliaires avec un développement resté normal.
Mais il reste encore à faire pour que cette production (particulièrement celle d'acide docosahexaenoïque) soit commercialement viable. Il faudrait d'abord accroître la production, et l'expérience passée montre que ce n'est pas évident.
La conversion en acide docosahexaenoïque n'a pas encore été explorée dans les plantes. Ona cloné un gène codant une Dð4-désaturase capable de convertir un acide docosopentaenoïque fourni en docosahexaenoïquechez une plante, mais on ne sait pas trop bien s'il existe des enzymes capables d'allonger spécifiquement l'acide eicosapentaenoïque en docosopentaenoïque in vivo.
Par ailleurs, les résultats de Qi et al. montrent une accumulation des PUFAs uniquement dans les feuilles, mais il faudrait qu'ils le soient dans les graines pour être utilisables facilement. Il faudrait donc que les LCPUFAs soient transférés de leur support phosphatidylcholine et converti en triacylglyerols, ce qui suppose l'existence d'acyles-transférases capables de réaliser l'opération. Le simple fait que les LCPUFAs finissent leur course sur la phosphatidylcholine indique que ces enzymes ne sont pas présentes chez la plante.
Enfin, ces LCPUFAs doivent pouvoir être utilsées par la graine pour sa germination sinon elle sera difficile. Les lipases correspondantes ainsi que la capacité des peroxysomes devront être adaptées. Cela fait beaucoup.
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Les Insectes et leur Maîtrise
51. Les produits sémiochimiques (constituant des signaux) émis par les plantes entraînent des modifications très diverses du comportement des insectes. Certains insectes acquièrent et séquestrent des composés de ce type et les utilisent comme phéromones ou comme précurseurs de ces substances commandant les interactions entre individus. D'autres ne produisent ou libèrent leur phéromone que sous l'effet de substances émises par leur plante préférée. Parfois, d'ailleurs ces substances volatiles végétales renforcent l'effet des phéromones des insectes.
Inversement, ces substances végétales exercent un effet de répulsif, avec un blocage des réponses aux phéromones et attirent prédateurs et parasitoïdes dès que les herbivores s'attaquent à la plante. On trouvera une revue sur le sujet dans GVP Reddy et al.; Trends in Plant Science 9 (MAY04) 253-261.
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53. Les femelles de nombreux moustiques sont dites anautogènes, c'est à dire qu'elles ont besoin d'un repas de sang pour se reproduire. On ne connaît pourtant pas grand chose, sur le plan moléculaire, de ce mécanisme crucial pour la transmission de maladies par ces vecteurs.
Les protéines du vitellus ovocytaire sont produites dans le corps gras. Cette vitellogenèse est commandée par la 20 hydroxyecdysone (20E). Mais ce stéroïde est incapable, à lui seul, d'activer la vitellogenèse. C'est l'accroissement de la concentration en acides aminés de l'hémolymphe après un repas sanguin qui est le signal complémentaire agissant par la voie dite TOR (Target Of Rapamycin). IA Hansen et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (20JUL04) 10626-10631.
La protéine kinase TOR est une kinase conservée intervenant dans la régulation de la prolifération cellulaire en jouant sur la synthèse des protéines, mais avec une foule de cibles. Son nom provient du fait que la rapamycine en est un inhibiteur. Certaines des cibles sont directement phosphorylées par TOR, mais beaucoup le sont indirectement (voir la revue de N Hay et al.; Genes & Development 18 (15AUG04) 1926-1945 pour une plus ample information, même si elle ne concerne que les TORs mammaliennes).
Hansen et al. ont utilisé l'inhibition de deux protéines de cette voie TOR elle-même et le tuberous sclerosis complex 2 par interférence ARN (RNAi). L'inactivation de TOR inhibe la stimulation par les acides aminés, tandis que celle du tuberous sclerosis complex 2 qui est un régulateur négatif de la voie TOR provoque une stimulation de la synthèse des protéines du vitellus.
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54. L'immunité naturelle des moustiques constitue une cible actuellement fort analysée pour voir si on ne pourrait pas trouver des moyens de détourner cette immunité pour éviter la transmission de protozoaires, filaires et virus divers qu'ils nous délivrent avec beaucoup de dextérité.
Un groupe, comportant plusieurs équipes de Taiwan, vient de caractériser 11 952 ESTs (Expressed Sequence Tags) d'Aedes aegypti (qui transmet virus de la fièvre jaune et de la dengue, Plasmodium et filaires) et 12 790 d'Armigeres subalbatus (le vecteur de la filaire de Bancroft donnant la filariose lymphatique dans l'Asie du sud-est) issus des hémocytes. LC Bartholomay et al.; Infection and Immunity 72 (JUL04) 4114-4126. Parmi les gènes caractérisés de façon exhaustive, on retrouve de nombreux gènes impliqués chez les Vertébrés dans l'immunité innée.
L'analyse des hémocytes n'est pas facile, car on ne sait pas les conserver sous une forme viable. On sait simplement qu'il en existe plusieurs sous-populations à fonctions différentes.
Les fonctions immunitaires ont été étudiées dans des systèmes modèles avec Escherichia coli, qui donne lieu à phagocytose, et Micrococcus luteus à un enkystement avec mélanisation.
Ces séquences ont été regroupées pour éviter les redondances et annotées dans la mesure du possible. Les résultats sont consultables dans la banque https://asap.ahabs.wisc.edu/annotation/php/ASAP1.htm. et sont complétées par celles sur le génome d'Anopheles gambiae.
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Les Biopesticides
55. Photorhabdus luminescens est un pathogène des insectes qui sert d'ouvre-boîte à un nématode, Heterorhabditis, qui l'héberge sous sa forme I dans son intestin dans le cadre d'une symbiose, et le libère dès l'invasion d'un insecte que les toxines bactériennes tuent en 48 heures. La production d'antibiotiques permet d'éviter la concurrence d'autres bactéries.
Les deux variants I et II sont tous deux pathogènes, mais diffèrent par bien des caractéristiques. Le variant I produit des cristaux protéiques, des agents antimicrobiens, des lipases, phospholipases, protéases. C'est lui qui est bioluminescent et qui est surtout associé au Heterorhabditis. La forme II est fortement atténuée sur tous ces plans et est incapable de dépecer enzymatiquement l'insecte ce qui le rend inutile aux nématodes.
La forme II a un métabolisme respiratoire beaucoup plus élevé, et maintiennent donc un gradient transmembranaire de protons nettement plus élevé. Ils poussent donc beaucoup plus vite que la forme I qu'ils surclassent alors dès l'accès à la nourriture (2-4 heures contre 14 heures). Ils apparaissent avec une fréquence notable quand la bactérie est cultivée in vitro et chez des nématodes cultivés avec une nourriture artificielle que la forme I considère comme de mauvaise qualité. Cette forme n'est cependant pas retenue par les juvéniles infectieux lors du cycle suivant et constitue probablement la forme libre dans le sol.
Cette variation phénotypique n'est pas une variation classique de phase. C'est un basculement irréversible de I vers II. Les données récentes indiquent que ce basculement implique plusieurs gènes.
L'inactivation des gènes cipA ou cipB (crystalline inclusion protein), codant les protéines du cristal de la souche NC1 de Photorhabdus, donne un variant bactérien ressemblant au type II. De plus, la surexpression du gène ner, codant une protéine se liant à l'ADN (nucleotide excision repair), assure le passage du type I au type II. Enfin l'inactivation, dans les types II, du gène hexA (intervenant dans la réparation de mésappariements, si je ne me trompe) restaure le type I.
Tout indique que la forme II résulte d'une répression de certains gènes .
Il existe des mutants de la bactérie incapables de symbiose (donc exhibant la forme II) qui apparaissent au cours de subcultures prolongées. Un système régulateur à deux composants AstR–AstS de ce basculement vient d'être décrit, après inactivation, par une équipe de l'Institut Pasteur S Derzelle et al.; Microbiology 150 (APR04) 897-910. Ce mutant modifie le patron temporel du basculement de phénotype (phenotypic switching). Le basculement du type I vers II est plus précoce pour les mutants. Cette mutation modifie également la production d'antibiotiques et la motilité. L'étude de l'expression protéique indique qu'AstRS permet, en fait, une adaptation à la phase stationnaire qui diminue l'avantage sélectif des formes I.
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55. Xenorhabdus nematophila est, lui, le symbiote insecticide du nématode du sol Steinernema carpocapsae. Il est contenu dans une poche intestinale du nématode et se comporte, en gros comme Photorhabdus (voir le paragraphe précédent). Le rôle des fimbriae de la bactérie est examiné par H He et al.; Microbiology 150 (MAY04) 1439-1446. Les fimbriae participent à la fixation des bactéries pathogènes sur les cellules hôtes. Celles d'Escherichia coli (Pap) et celles de type I de Proteus permettent la colonisation de l'intestin humain et des voies urogénitales. Elles jouent également un rôle dans l'interaction symbiotique entre Vibrio fischeri et le calmar Euprymna scolopes (voir le Bulletin de Juin §96).
L'opéron mrx code ces fimbriae. Il comporte cinq gènes uniquement structuraux (mrxACDGH) alors que les opérons du même type en comportent plus d'une dizaine.
Contrairement à l'opéron homologue, mrp, de Proteus mirabilis, on ne trouve pas de gènes de recombinase spécifique au voisinage. C'est un système d'assemblage de type chaperone/usher qui est utilisé.
Par opposition avec le système général de sécrétion (type II), ou déclenché par le contact entre pathogène et hôte (type III), ce système chaperone/usher n'implique que deux protéines spécifiques, une chaperone périplasmique et la protéine usher (huissier) dans l'exportation à travers la membrane externe. La chaperone périplasmique replie la protéine et la transmet, pour exportation, sous cette forme à la protéine usher de la membrane externe.
La région intergénique entre le gène de la principale protéine fimbriale (mrxA) et le gène usher (mrxC) est dépourvue d'un gène mrpB-like, mais contient trois répétitions en tandem. Le promoteur canonique reconnu par le facteur de transcription sð70 en amont de mrxA, ne subit pas l'inversion qui induit ou supprime l'expression pour les fimbriae Pap codées par l'opéron fim, et l'opéron mrp de Proteus. La production des fimbriae est, par contre, conditionnée par une protéine régulatrice à leucines (Leucine-responsive regulatory protein, Lrp). Tout ceci en fait un système un peu spécial.
Mais on ne sait toujours pas si ces fimbriae jouent un rôle dans l'interaction entre la bactérie et le nématode, bien qu'elle soit présente dans les poches intestinales à bactéries.
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Les Productions animales
Les Génomes
56. EE Thomas et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (13JUL04) 10349-10354 ont étudié la distribution de petites duplications de 25 à 100 pb dans le génome des Mammifères. On sait qu'il existe des duplications de plus grande ampleur. Chaque doublet consiste en une réplique exacte d'une même séquence séparée par une certaine distance. Cette distance n'est pas aléatoire, soit d'environ 100 pb, soit de 1000 pb. la comparaison des génomes humain et de celui de notre frère le chimpanzé montre que la plupart de ces doublets sont issus d'une insertion n'entraînant pas de modifications des séquences avoisinantes. Les évènements récents de ce type (après la divergence humain) ont donné des doublets proches (100pb) et ce type est donc probablement le plus dynamique.
L'examen de la situation chez la souris, Caenorhabditis elegans et Arabidopsis indique que ces évènements sont très répandus. Un tel mécanisme a peu de chances d'entraîner des conséquences sur l'évolution des séquences régulatrices ou codantes.
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La transformation
57. M Schmidt et al.; Journal of Virology 78, n°12 (JUN04) 6509-6516 ont cloné et caractérisé un virus AAV (Adeno Associated Virus) bovin, BAAV. Son génome présente 4 693 pb dont l'organisation et semblable à celle des autres AAV connus. Une divergence plus forte pour les parties les plus extérieures de la protéine VP3 majeure de capside assure une absence de réaction immunologique croisée avec les AAV-2, AAV-4 ou AAV-5, ce qui est une qualité pour un vecteur devant éviter une réaction immunitaire causée par des transformations antérieures par le même type de vecteurs. Il a pu être caractérisé, classiquement, comme un contaminant de cultures produisant l'adénovirus bovin type 1.
Ses tropismes cellulaires indiquent qu'il pourrait constituer un vecteur ayant des ciblages différents. Dans un modèle murin de ciblage vers la glande salivaire; ce BAAV est une dizaine de fois plus efficace que l'AAV-2.
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Le développement
59. Les membres de la famille des récepteurs des LDL (Low Density Lipopotein), Lrp5 et Lrp6, sont des co-récepteurs dans la transduction du signal Wnt. OG Kelly et al.; Development 131 (JUN04) 2803-2815 ont inactivé ces deux gènes et constaté qu'ils sont indispensables à la gastrulation de la souris. Leur fonction est redondante de sorte qu'il faut inactiver les deux gènes pour observer un effet. Ils sont surtout important pour la détermination et la différenciation de la partie postérieure de l'épiblaste.
Un phénotype similaire est observé pour les mutants de Fgf8 et du récepteur. Tout se passe comme s'il existait un lien entre les voies Fgf et Wnt dans la mise en œuvre du patron du mésoderme postérieur et plus généralement avec la voie Nodal.
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La Physiologie
60. Les stratégies pour analyser les données des réseaux d'expression et leurs variations au cours d'une période de temps donnée nécessitent une intégration de nombreuses variables. Pour exploiter pleinement ces données dans un contexte biologique, il faut disposer d'une description de la modification des phénotypes. La description quantitative des métabolites présents comme celle fournie par la résonance magnétique nucléaire du proton ou la spectrométrie de masse peut être utile dans le cas d'une fonction métabolique donnée (génomique fonctionnelle). JL Griffin et al.; Physiological Genomics 17 (APR04) 140-149 ont ainsi analysé l'induction du foie gras par l'acide orotique chez des rats Kyoto qui y sont plus prédisposés que le Wistar classique.
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61.### Beaucoup de venins s'attaquent à des canaux ioniques membranaires. Ces canaux sont des canaux ouverts par divers stimuli comme la présence d'un ligand ou par la différence de potentiel transmembranaire ou un stress mécanique. Dans le cas des venins d'araignées, on pense usuellement que leur haute affinité pour le canal est responsable de leur action. SY Lee et al.; Nature 430 (08JUL04) 232–235 et TM Suchyna et al.; p.235–240 viennent d'étudier le mécanisme d'action de deux toxines issues de la tarentule rose du Chili (quel joli nom) Grammostola spatulata qui interagissent avec deux canaux ioniques différents. La toxine GsMTx4 agît spécifiquement sur les canaux SACs (Stretch-Activated cation Channels) sensibles à la tension mécanique, la toxine VSTX1 sur les canaux du potassium, KvAP, commandés par
le voltage. Les deux équipes ont étudié la structure de ces toxines et constatent que l'inhibition des deux toxines se fait par une partition au sein de la membrane où la partie hydrophobe est attirée, après quoi la toxine empêche l'interaction entre le capteur situé à l'interface entre protéine du pore et membrane.
Voir également le commentaire et le schéma clair de ML Garcia; Nature 430 (08JUL04) 153.
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62. Sous un titre pompeux, LB Gladden; Journal of Physiology 558 (15JUL04) 5-30 envisage le rôle de l'acide lactique dans le métabolisme. Ce n'est pas seulement un cul de sac métabolique en cas d'hypoxie. L'acidose observée lors d'exercices violents n'est souvent qu'une forme extrême, et l'acide lactique est, en réalité, un intermédiaire intervenant dans la réparation des blessures et la régénération, entre autres. Le lactate est une source d'énergie très mobile en aérobiose et peut-être un médiateur de la modulation du potentiel redox entre différents compartiments entre et dans les cellules
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63. MH Dave et al.; Journal of Physiology 558 (15JUL04) 597-610 décrivent des transporteurs hétéromériques de l'intestin qui sont, en réalité des échangeurs spécifiques de certains acides aminés. Ils comportent deux sous-unités : une protéine transmembranaire catalytique, dite légère, et une chaîne lourde qui est une glycoprotéine. Cette dernière (qui existe sous deux formes) peut être associée avec une série de sept chaînes légères conférant chacune une spécificité.
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Le système immunitaire
64. La plupart des cellules exhibent à leur surface un très grand nombre de protéines hétérodimériques de type MHC-I, toutes enserrant dans une fente un petit peptide provenant d'une dégradation intracellulaire naturelle de protéines cellulaires. Elles font de même pour les peptides issus de protéines virales ou bactériennes. Ces signaux périphériques sont reconnus par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques activés qui détruisent ces cellules potentiellement dangereuses. Mais le processus est naturellement auto-destructeur à cause de la présence de peptides autochtones, ce qui entraîne un risque d'auto-immunité. Il existe donc un mécanisme assurant une régulation étroite de ces mécanismes.
Celle-ci est, en partie, assuré par des cellules professionnelles présentatrices d'antigènes (pAPCs) issues de la moelle osseuse. Lorsque ces cellules sont infectées elles engendrent, comme les autres, des peptides découpés intracellulairement, après avoir été ubiquitinylées, dans les protéasomes cytosoliques (de gros complexes particulaires multicatalytiques). Ces peptides sont ensuite transportés dans le réticulum endoplasmique par les TAPs (Transporter associated with Antigen Presentation) et insérés dans la fente des nouvelles molécules de MHC-I par d'autres protéines du réticulum (tapasine, calréticuline et Erap57). Les complexes peptide–MHC-I sont ensuite convoyés vers la surface par le système sécrétoire classique que l'on peut bloquer par la Bréfeldine A.
Les pAPCs possèdent, en outre, un système spécial pour les peptides provenant de l'extérieur. C'est ce que l'on appelle la présentation croisée, qui est mise en jeu quand un virus, par exemple, n'est pas capable d'infecter une pAPC, ou ne lui laisse plus la possibilité de présenter les antigènes. Bien que les pAPCs soient capables de présenter des antigènes solubles, elles préfèrent de loin les antigènes particulaires, et donc acquis par phagocytose. C'est le cas de cellules infectées qui peuvent être phagocytées. Les antigènes présents dans le phagosome sont ici exportés vers le cytosol où ils sont dégradés par le protéasome. Ils suivent alors les voies de présentation par le réticulum après retour vers ce réticulum.
Mais les produits de la phagocytose (comme les peptides endocellulaires) sont, en principe, présentés non pas par les MHC-I, mais par le MHC-II. Ceci a été montré pour des mycobactéries, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Brucella abortus et des Leishmania. Comme les deux types de peptides antigéniques se retrouvent dans un même bocal, ils sont présentés par les MHC-I.
Cette présentation croisée utilisent deux voies alternatives dans le cytosol, soit la voie classique décrite plus haut, soit la voie vacuolaire où les peptides sont chargés sur des molécules de MHC-I recyclées de la membrane plasmique. Cette dernière voie ne nécessite pas les TAPs.
Comme on pensait que la formation des phagosomes a lieu au niveau de la membrane plasmique, on s'émerveillait de la formidable capacité de cette membrane à fournir, en quelques minutes, les surfaces exigées par la phagocytose d'une cellule apoptotique, par exemple. En fait on s'est aperçu que la membrane du phagosome contient des protéines du réticulum comme la calnexine et la calréticuline. Ceci est dû au fait que le réticulum fusionne avec la coupe qui se forme aux débuts de la phagocytose et c'est par piratage de membranes du réticulum que se fait l'expansion du phagosome. C'est ce qui permet de combiner les deux présentations.
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65. Notch est impliqué dans de très nombreux mécanismes du développement. C'est un récepteur de surface de la cellule qui est activé directement par des ligands des familles de protéines Delta ou Serrate/Jagged émis par des cellules voisines.
Deux articles soulignent un nouveau rôle dans la réponse des cellules T. D Amsen et al.; Cell 117 (14MAY04) 515-526 et K Tanigaki et al.; Immunity 20 (MAY04) 611-622 commentés par SM Lehar et al.; Nature 430 (08JUL04) 150-151.
Les lymphocytes T CD4+ vont devenir des T helpers 1 ou 2 (Th1 ou Th2) suivant la combinaison de cytokines qu'elles vont produire.
Les cellules Th1 assure l'immunité cellulaire contre les cellules infectées par les virus ou des bactéries intracellulaires. Elles déploient des MHC-II et produisent l'interféron-gð (IFN-gð). Les cellules Th2 facilitent le développement de l'immunité en sécrétant l'interleukine 4 (IL-4).
Les cytokines des cellules Th1 et Th2 s'inhibent réciproquement dans leurs différenciations et leurs fonctions effectrices. C'est une réponse Th1 quand les cellules dendritiques (des présentatrices professionnelles d'antigènes) sont stimulées par un antigène via un récepteur du type Toll (c'est à dire correspondant à l'immunité innée et reconnaissant des patrons généraux reconnus dans les agresseurs).
Après cette reconnaissance, les cellules dendritiques migrent vers les organes lymphoïdes où elles discutent avec les cellules T, leur racontant ce qu'elles ont rencontré. De l'efficacité de ce dialogue va dépendre la réaction des cellules T avec une éradication de l'intrus ou, au contraire, des réactions intempestives du système immunitaire. La sécrétion de l'IL-12 par les cellules dendritiques est un des signaux enjoignant aux cellules T indifférenciées (naïves) CD4+de se convertir à la lignée Th1.
Les cellules Th2 répondent à des cellules dendritiques ayant reconnu un pathogène multicellulaire comme un ver parasite. Mais le mécanisme de cette orientation, désigné par la notion parfaitement absconse de polarisation est inconnu.
La conversion alternative est liée à l'intervention côté cellule dendritique, de récepteurs Toll-like qui provoque l'expression membranaire du ligand Delta de Notch et la production de l'IL-12. Pendant ce temps le pathogène est découpé dans la cellule, et l'antigène associé au MHC est présenté à la cellule naïve grâce au récepteur TCR ce qui provoque l'induction du gène de l'INF-gð.
Comment? c'est une autre histoire. Mais dans le cas de vers parasites et de la détermination Th2, les deux publications montrent que le ligand Jagged interagit avec Notch dont le domaine cytosolique, libéré par clivage du récepteur, se lie à un facteur de transcription particulier, RBPJk (pour Recombination signal-Binding Protein J kappa) et intervient sur l'enhancer aval du gène de IL-4. Cette cytokine a, d'ailleurs, un effet autocrine sur sa propre cellule productrice. Il y a donc utilisation de deux ligands différents et dans le cas des Th2, une interaction directe avec l'enhancer du gène de l'IL-4.
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66. Si on peut facilement comprendre le principe de la reconnaissance, par les récepteurs Tolllike (TLRs) du système immunitaire inné, des patrons communs aux bactéries, il n'en est pas forcément de même dans le cas des virus où ces patrons communs sont moins évidents.
On croit bien comprendre ce qui se passe avec le système immunitaire adaptatif avec ses multiples types cellulaires dont les lymphocytes B et T. On commence seulement à se pencher sur ce problème dans les premières défenses de l'organisme que constitue le système inné.
Je rappelle que ce système est caractérisé par ses récepteurs reconnaissant des patrons moléculaires communs à une catégorie de pathogènes et qui ne nécessite donc pas une exposition préalable à un antigène.
Beaucoup de virus à ARN simple brin (ssRNA) comme le virus de la grippe se fixent sur des récepteurs de la membrane plasmique avant d'être incorporés dans un endosome. Leur enveloppe fusionne avec la membrane de l'endosome, ce qui libère la nucléocapside dans le cytosol. Mais au cours du séjour un peu délétère dans le milieu acide de l'endosome, une partie de l'ARN est libéré. Or l'endosome humain contient le TLR8 (hTLR8) alors que c'est le mTLR7 chez la souris. Ils reconnaissent les ssRNA (plus particulièrement les motifs poly(U) et poly(U/G) pour hTLR8] qui déclenchent l'activation du récepteur et la cascade de signaux en aval, notamment MyD88 (Myeloid Differentiation factor 88), l'IRAK4 (IL-1 Receptor-Associated Kinase 4) puis le TRAF6 (Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor 6), activant NF-kB et la production de cytokines inflammatoires.
mTLR7 et hTLR8 activent également une voie MyD88-indépendante de l'IRF-3 (IFN Regulatory Factor-3) ou les TLRs 3 et 9 sont également et respectivement activés par des ARNs doubles brins et des ADN avec CpG non méthylés comme l'ont montré JM Lund et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (13APR04) 5598–5603 commenté dans le Bulletin de Juillet §99.
Le fait que les virus aient inventé des moyens de contourner ces obstacles prouve bien qu'ils sont importants.
Un commentaire illustré de K Krozat et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (04MAY04) 6835-6836 et une revue de KW Boehme et al.; Journal of Virology 78,n°15 (AUG04) 7867–7873, font le point sur ce que l'on sait des diverses voies à départ membranaire ou endosomiques.
TLR-7, -8 et -9 sont évolutivement voisins et TLR-9 est un capteur d'ADNs non méthylés. TLR-3 est plus distant de ce groupe et c'est un capteur des ARN doubles brins. TLR-3, -7, -8 et -9 sont tous localisés dans les endosomes et y sont ciblés par leur domaine cytoplasmique. Ils fonctionnent indépendamment les uns des autres
Quand aux voies connues on peut les résumer comme suit. La stimulation de TLRs-7 ou -9 provoque la production d'interférons að/ðbð, mais on ne sait toujours pas comment. Par contre TLR-2, qui peut être associé en dimère avec soit TLR-1 soit TLR-6 utilise TIRAP/MAL comme adaptateur pour stimuler NF-kB qui induit la production de cytokines inflammatoires, TLR-1 et –6 utilisant Myd88. TLR4 agit seul associé à MyD88, TRIF et l'adaptateur TRAM (TRIF-Related Adaptor Molecule) pour activer IRF3 et la voie des interférons. TLR3 utilise TRIF, mais pas TRAM, pour activer IRF3. TLR-7, -8 et -9 déclenchent la synthèse des interférons, mais, en dehors de MyD88, on ne sait pas grand chose des intervenants.
On trouvera, d'ailleurs, dans L Malmgaard; Journal of Interferon & Cytokine Research 24 (AUG04) 439-454, une revue sur l'induction et la régulation de la production des interférons durant les infections virales.
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Les Vaccins
67. Des vaccins, tout particulièrement contre la variole disparue, mais dont on craint un usage bioterroriste, ont bien des ennuis. Du coup les Etats-Unis qui en ont acheté 200 millions de doses, misent sur plusieurs chevaux. Il y a bien la vaccine (une variole bovine dont on avait constaté l'effet protecteur chez les vachers) plus que centenaire contre la variole, mais avec des effets secondaires sévères chez certaines personnes
Des effets secondaires inattendus d'un nouveau vaccin contre la variole d'Acambis (autrefois Peptide Therapeutics Group PLC) vont pour le moins retarder sa mise au point (c'est un vaccin dérivé du Dryvax"!).
Il s'agit de plusieurs cas de myopéricardite au cours des essais cliniques, aussi bien avec le nouveau vaccin ACAM2000"! que le vaccin traditionnel Dryvax"! de Wyeth pris pour référence. E Check; Nature 428 (22APR04) 789.
L'éradication finale de la variole a été réalisée par le vaccin Dryvax"! durant les années 60s et 70s sans aucun incident de ce type qui ait été signalé.
Acambis avait , obtenu un contrat très convoité de 500 millions de dollars pour 210 millions de doses du vaccin ACAM2000"! qui viennent s'ajouter aux 80 millions de doses d'anciens vaccins disponibles. Alors que ses dirigeants expliquaient les raisons de leurs succès dans une interview le 24 Février (A Tsao; Business Week (03MAR04) BusinessWeek Online), à la question de savoir si tout était prêt à l'usage, la firme a répondu que non et qu'il restait quelques interrogations sur la sécurité.
En effet, les essais de phase III (vérification de l'efficacité, si je ne me trompe) ont été arrêtés le 13 Avril, alors que les doses sont prêtes. C'était un risque
couru, vu l'urgence. Le contrat suppose à présent un renouvellement des doses périmées, ce qui laisse une ambiguité. Est-ce qu'une dose toxique est périmée?
Mais, depuis le début de la vaccination en Décembre 2002 par le vaccin Dryvax des personnels militaires, 77 cas de myopéricardite ont été dénombrés sur 615 149 vaccinés, ce qui suggère que des cas antérieurs ont du exister, mais n'ont pas été notés. Du coup, la compagnie a du doubler le nombre des sujets pour l'essai clinique de stade I (toxicité) pour le vaccin contre le virus West Nile.
Le gouvernement américain est donc perplexe et envisage de n'utiliser ce vaccin payé qu'en cas d'urgence en attendant qu'une version améliorée du virus vaccinal Ankara (MVA) soit disponible en quantités suffisantes. Ce dernier vaccin résulte de très nombreux passages sur fibroblastes de poulet et s'est révélé beaucoup plus sûr que le Dryvax"! lors de son utilisation en Allemagne dans les années 70s. Mais c'est un vaccin vivant, et qui pourrait réserver des surprises désagréables. M Enserink; Science 304 (07MAY04) 809. On essaye, par ailleurs, au U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) de Fort Detrick de développer un vaccin ADN composé de quatre gènes codant des protéines qui semblent importantes dans la stimulation de l'immunité. Cela semble marcher chez les rongeurs, mais surtout chez les singes rhésus, ce qui est un progrès, mais ne permet pas de conclure à une efficacité chez l'homme que l'on ne peut vérifier sans raisons très fortes. De toute façon, et comme souvent pour les vaccins ADN, un rappel par des protéines elles-mêmes est requis.
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Les Pathogènes
68. La nécessité de détecter et identifier rapidement les agents potentiels de bioterrorisme est probablement facilitée par leur faible nombre. Un article de RN Charrel et al.; BMC Microbiology 4 (17MAY04) 21 (des chercheurs de Marseille) montre comment on peut construire des plasmides composites possédant, chacun, quatre à six signatures de ces agents, à l'exclusion des virus à ARN. Les deux premiers plasmides sont dédiés aux agents des listes A et B des Centers for Disease Control and Prevention américains. L'un d'entre eux est dédié à la variole et d'autres pathogènes pouvant causer des lésions cutanées pouvant être confondues. Il comporte des séquences consensus d'autres Orthopoxvirus, d'Herpèsvirus, Varicelle, Rickettsia akari. La sensibilité annoncée va de 1 à 100 copies de l'ADN recherché et l'essai est quantitatif. Un système destiné à éliminer les faux positifs dus aux tests par les autres plasmides de détection, est décrit. Il comporte un site de restriction par NotI. Ce système permet d'éviter les très nombreux essais résultant du nombre des agents possibles. De toute façon les seuls kits disponibles sont ceux contre B. anthracis, Brucella sp., Francisella tularensis et Yersinia pestis.
Il est évident que le problème posé par l'inaccessibilité actuelle aux souches pathogènes complique la tâche. Mais les auteurs ont bien vérifié que cela fonctionne pour Coxiella. burnetii, C. psittaci, Burkholderia, Bacillus anthracis, Yersinia. pestis, Rickettsia. prowazekii et Francisella. tularensis, tous agents de pneumonies.
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69. Trente nouveaux cas d'infection par le virus Nipah sont apparus au Bengladesh. Plusieurs épidémie localisées dues au virus Nipah s'étaient déjà déclarées en Asie du Sud-Est. C'est un morbillivirus souvent mortel pour l'homme et voisin des virus australiens Hendra et Menangle. D Butler; Nature 429 (06APR04) 7. Mais ces infections ne sont pas directement transmissibles entre humains, car son hôte naturel est une chauve souris frugivore, Pteropus, et il faut un contact avec ces mammifères ou leurs déjections. L'épidémie malaise de 1998 (confondue par les autorités avec celle par un virus d'encéphalite) était liée à une transmission du porc à l'homme, Comme dans le cas du virus Menangle, le virus Hendra ayant été transmis par le cheval. Une épidémie différente (ne serait ce que parce que la transmission par le porc est peu vraisemblable) s'est déclenchée récemment au Bengladesh avec des symptômes surtout nerveux, et le virus semble sensible à une immunisation par un virus de la vaccine exprimant deux des protéines périphériques du virion. De plus une immunothérapie par sérum de hamster est apparemment possible.
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70. Le virus de la peste bovine (Rinderpest) cause une maladie fébrile aigue très contagieuse. C'est un Morbillivirus (paramyxovirus), donc à génome unique ARN simple-brin de 15 882 nucléotides de polarité négative (devant être transcrit avant traduction) avec six gènes viraux.
L'hémaglutinine de ce virus joue un rôle important dans la spécificité d'hôte du virus, mais d'autres protéines du virus interviennent dans la modulation de sa pathogénicité.
La polymérase ARN dépendante du virus fait intervenir deux des protéines virales: la phosphoprotéine P et la grosse protéine L. Chez les paramyxovirus, la protéine P est un transactivateur et c'est la protéine L qui est la polymérase. Au moins chez le virus Sendai (un autre paramyxovirus), le complexe P–L se lie à l'ARN viral via la protéine P. On vient de montrer que la phosphoprotéine P est le déterminant majeur de la pathogénicité. M Yoneda et al.; Journal of Virology 78, n°12 (JUN04) 6676-6681
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71. Le virus de la peste porcine est un virus de la famille des Flaviviridés (celle du virus de la fièvre jaune, de la diarrhée virale bovine et de l'hépatite C). Son génome de 13 kb est un ARN simple brin directement traductible mais non polyadénylé. Il code une unique polyprotéine.
Ses manifestations vont d'infections inapparentes, chroniques mortelles en 30 jours à des forme très virulente avec mort soudaine du porc. Le signe le plus constant de cette infection est une leucopénie. Cette disparition des lymphocytes est due à l'induction de la production du TNF-að ð(Tumor Necrosis Factor að) qui provoque une apoptose (mort programmée) des lymphocytes. C Choi et al.; Archives of Virology 149 (MAY04) 875-889.
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72. La maladie de l'amaigrissement du porcelet (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS) est apparue au Canada au début des années 90s. Elle est causée par le circovirus 2 (voir le Bulletin de Janvier §71). Ce virus n'a été formellement décrit qu'en 1997. Là encore, on observe une déplétion des lymphocytes qui entraîne plusieurs infections secondaires opportunistes, ce qui explique la diversité des symptômes observés. Ce circovirus est caractérisé par un génome à ADN simple brin d'environ 2000 nucléotides.
Une courte revue porte sur la pathogenèse de ce virus avec L Darwich et al.; Archives of Virology 149 (MAY04) 857-874.
On ne sait pas quelles sont les cellules qui sont à l'origine de la dissémination du virus dans tous les tissus, même si macrophages et cellules dendritiques sont infectées. Les tropismes du virus semblent évoluer avec l'âge du porcelet, probablement en fonction de la richesse en cellules en cours de duplication. Il semble, en effet, que ce virus comme les autres Parvovirus des Mammifères ait besoin de cellules en phase S du cycle cellulaire, car il ne code pas sa propre polymérase. C'est ce qui explique la difficulté de reproduction de l'infection. Un des moyens utilisés pour l'entretenir au laboratoire est de stimuler les réactions immunitaires ce qui augmente rapidement le nombre de cellules en voie de duplication.
Les élevages de porc sont abondamment infectés par ce virus au vu des études sérologiques. La revue porte surtout sur le rôle du système immunitaire dans le développement de la maladie. On ne sait toujours pas si les macrophages sont directement infectés grâce à un récepteur idoine, ou si le virus ne les envahit que secondairement après "consommation" d'autres cellules infectées. La position actuelle serait que les deux voies jouent, mais le récepteur n'a pas encore pu être identifié. .
Les sites d'infection primaire pourraient être les tissus épithéliaux, comme dans le cas d'un autre virus du groupe s'attaquant au perroquet. La très forte charge des macrophages serait secondaire. Par ailleurs plusieurs des symptômes seraient plus des effets secondaires de la maladie que des effets directs du virus, ce qui expliquerait leur diversité. En ce qui concerne les populations de cellules lymphoïdes, les effets sont constants mais évoluent avec le déroulement de l'infection, et en particulier l'issue de la maladie. Dans les cas naturels, on constate que les cellules CD4+, CD8+ et surtout les précurseurs double-positifs disparaissent nettement. Les cellules NK et les lymphocytes T gðdð ont presque complètement disparu au vingt et unième jour après l'infection chez les porcelets qui développent la maladie. Or les lymphocytes T gðdð,ð ð bien que peu nombreux sont en première ligne aux surfaces mucosales et, bien que ne disposant que des capacités de reconnaissance plus limitées que les cellules aðbð,ð sont néanmoins capables de s'attaquer à un large spectre d'antigènes. Chez les autres on constate une récupération des cellules CD8+.
En ce qui concerne les cytokines, on se heurte à un paradoxe. Le virus lui-même modifie la réponse de cytokines quel que soit le statut final de l'animal, immun ou malade. On ne sait pas trop bien pourquoi, mais une co-infection accroissant les défenses immunitaires, semble présager une issue favorable pour l'animal, bien que des facteurs génétiques ne soient pas exclus.
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74.. Le virus CCHF (Crimean-Congo Haemorrhagic Fever) est un virus enzootique du bétail et de la faune sauvage transmis par les tiques qui sévit au Moyen-Orient, en Asie centrale et en Afrique, ainsi que dans les Balkans. C'est un Bunyaviridé, et donc à génome ARN simple brin tripartite (avec trois segments dénommés L,M et S, selon leur taille respective) de polarité négative (non directement traductible). Il n'est mortel que pour l'homme avec un taux de 10 à 80% suivant le mode de transmission.. Les segments génomiques S de plusieurs souches du virus ont été séquencés. R Hewson et al.; Virus Research 102 (15JUN04) 185-189. Son maintien dans la nature implique manifestement plusieurs hôtes et vecteurs potentiels. Concernant les vecteurs, le plus efficace est la tique Hyalomma. L'analyse du segment génomique S indique qu'il est manifestement transporté, probablement grâce au commerce du bétail.
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75. Rickettsia prowazekii, est l'agent du typhus et c'est une bactérie intracellulaire obligatoire. Elle réside dans le cytosol de la cellule hôte sans aucune membrane interposée. Elle est bien équipée pour se fournir en énergie aux dépens de la cellule. Malgré cette adaptation remarquable elle est relativement éclectique en ce qui concerne ses hôtes, de l'homme à la puce qui la transmet et dont elle détruit les cellules avant de passer à une autre.
La séquence de ce génome est maintenant disponible ainsi que celles de plusieurs autres rickettsies.
Ce génome contient 834 ORFs (Open Reading Frames), quelques pseudogènes et une proportion non négligeable de régions non codantes. Mais les annotations actuellement disponibles sont souvent fantaisistes et un examen fonctionnel serait le bienvenu. La difficulté réside dans son mode de vie et à la difficulté à y faire intervenir des outils moléculaires. A Qin et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (MAY04) 2816-2822 viennent de montrer que la mutagenèse transpositionnelle est utilisable.
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76. Francisella tularensis, est une bactérie intra-cellulaire. Elle est englobée dans le phagosome des macrophages, mais réussit à éviter sa destruction en empêchant l'acidification prélude à la destruction, avant de passer dans le cytosol. On vient de montrer que c'est ce qui se passe, à la fois pour une souche virulente récemment isolée et la souche vaccinale LVS. DL Clemens et al.; Infection & Immunity 72 (JUN04) 3204-3217.
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77. Les systèmes de sécrétion dits de type III de bactéries pathogènes sont destinés à injecter des protéines dans la cellule cible, ce qui facilite l'invasion. Ces systèmes fonctionnent comme dans le cas de l'exportation des protéines flagellaires et il s'agit très certainement d'un système ayant divergé de ce dernier au cours de l'évolution.
La bactérie pathogène Campylobacter jejuni en est, apparemment, dépourvue. On vient de montrer que dans ce cas la protéine FlaC qui est homologue des extrémités N- et C-terminales des protéines flagellaires FlaA et FlaB, mais dépourvue de la partie centrale, est sécrétée dans le milieu directement par le système d'exportation flagellaire, or elle est impliquée dans la reconnaissance des cellules cibles sur laquelle elle permet à la bactérie de se fixer et doit jouer un rôle dans l'invasion cellulaire. YC Song et al.; Molecular Microbiology 53 (JUL04) 541-553.
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78. La protéine prion de plusieurs souches de la scrapie (tremblante du mouton et de la chèvre) a été analysée par des chercheurs de Lyon. On peut les distinguer par la maladie induite chez la souris et par la mobilité électrophorétique. Ces protéines ont été exprimées dans des souris normales et des souris transgénique exprimant la PpP ovine. Les auteurs montrent qu'on peut bien identifier les différentes formes ovines du prion et les distinguer du prion de l'encéphalite spongiforme.
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79. Une partie du même groupe montre que l'infection par le prion est un phénomène qui peut être associé à une polarisation cellulaire. On peut, en effet, propager des prions dans des cellules non neuronales comme les cellules épithéliales Rov (RK13 qui dérivent du rein de lapin) transfectées avec un gène de PrPC ovine sous la commande d'un promoteur inductible. L'infection est nettement plus facile du côté apical de ces cellules épithéliales polarisées. S Paquet et al.; Journal of Virology 78, n°13 (JUL04) 7148-7152.
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Les animaux transgéniques
80. La sélection d'un taureau reproducteur est longue et coûteuse. Il faut en effet tester les descendants avant de le proclamer "reproducteur d'élite". Il arrive ainsi souvent qu'il le soit vers six ou sept ans, ce qui raccourcit d'autant sa carrière commerciale. Ceci justifie, malgré ses succès très limités, le clonage. Le clonage en série de mammifères a uniquement été réalisé chez la souris, mais on vient de le faire pour un taureau, avec une seconde génération de taureaux clonés à partir d'une première, grâce à des noyaux de la peau. C Kubota et al.; Nature Biotechnology 22 (JUN04) 693-694.
La première et la deuxième génération "paraissent" saines selon les auteurs, et leurs télomères présentent une longueur normale, la télomérase étant fonctionnelle dans les embryons clonés. Malheureusement la troisième génération n'a pas pu être réalisée, ce qui contredit une peu la précédente affirmation et rend cette génération inutile, au moins en tant que reproducteurs, et pour le beefsteak c'est un peu cher.
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Les Productions Microbiennes
81. La première ébauche de la séquence génomique complète du champignon de pourriture blanche, Phanerochaete chrysosporium, vient d'être publiée par D Martinez et al. Nature Biotechnology 22 (JUN04) 695–700. (voir également http://www.jgi.doe.gov). Ce champignon est déjà utilisé pour la conversion de la plupart des composants du bois. Cellulases et hémicellulases permettent de dissocier le matériel polysaccharidique, tandis qu'oxydases et peroxydases dissocient plus ou moins complètement la lignine. Ce sont surtout ces dernières qui sont intéressantes, car on ne dispose pas de beaucoup d'enzymes de ce type qui soient efficaces sur le plan industriel (les champignons ont le temps et pas d'actionnaires). Ces enzymes relativement peu spécifiques permettent également de détoxifier de nombreux xénobiotiques, le plus souvent sans bénéfice pour le champignon, toxines pesticides, hydrocarbures polyaromatiques, biphényles polychlorés et autres dérivés halogénés, dérivés nitrés, dont les explosifs, cyanures, azides, etc….Voir également le commentaire de TT Teeri ; p.679-680.
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82. ### Une revue sur l'analyse protéomique de la sécrétion chez Bacillus subtilis (la souche 168) est parue dans H Tjalsma et al.; Microbiology & Molecular Biology Reviews 68 (JUN04) 203-207. Il faut rappeler que cette bactérie est, avec d'autres Bacillus voisins, un outil industriel important dans la production de protéines autochtones ou hétérologues, notamment d'enzymes. De plus, la séquence complète de son génome associée à des bibliothèques très fournies de mutants en fait un bon outil.
Cette revue est très dense, car elle examine pratiquement tous les acteurs connus.
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83. ### L'utilisation des chocs thermiques (en général 42°C) est utilisée pour induire la production de protéines hétérologues, mais avec certaines limitations. On a donc créé des vecteurs à expression cryophile comme les pET14. G Qing et al.; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 877–882 décrivent un système d'induction à basse température chez Escherichia coli, le système pCold où le système d'expression est réprimé à 37°C et fonctionnel entre 15 et 23 °C. Comme la plupart des protéines autochtones ne sont presque plus synthétisées la cellule ne produit plus que la seule protéine recombinante. On peut ainsi, malgré la température relativement basse, produire 200 mg/l et la purification n'est souvent pas indispensable.
La protéine CspA (Cold shock protein A) est produite par E coli à raison de 13% des protéines totales une heure après un passage de 37°C à 15°C, puis retourne à son niveau de base. L'essentiel du mécanisme d'accumulation repose sur une meilleure stabilité du message. D'autres membres de la famille CspA facilitent le dépliement des messagers et donc la traduction à basse température (S Phadtare et al.; Journal of Molecular Biology 337 (12MAR04) 147-155, même équipe).
Mais parallèlement à la chute de la production de CspA après une heure, celle des protéines recombinantes dont le gène est mis sous la commande du promoteur cspA, baisse et on doit pratiquer des cycles de refroidissement-réchauffage, ce qui est contraire à toute production commerciale.
L'équipe avait montré antérieurement que des mutations non-sens de cspA inhibent la synthèse protéique ce qui conduit à la mort cellulaire. Cet effet requiert la partie non traduite du gène cspA (5'UTR) est dû à la séquestration des ribosomes sur le site d'initiation de la traduction du messager de cspA, ce qui accroît, au passage leur stabilité.
Les auteurs ne soutiennent pas leur système pour une utilisation industrielle, mais pour la production à haut débit de protéines pour une analyse ultérieure, notamment par RMN. Ils ont ainsi exprimé 38 protéines d'origines variées. Voir également le commentaire de CH Schein; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 826-827.
Ces vecteurs sont disponibles chez Takara Bio inc.(Otsu, Shiga, 520-2193, Japan, http://bio.takara.co.jp.
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85. ### Comme je le mentionnais dans le Bulletin de Mai 2003 §133, l'utilisation du xylose est quasiment une exigence majeure dans la production de bioéthanol, car le seul substrat économiquement défendable est la lignocellulose qui n'entre pas en compétition avec les usages alimentaires. Malheureusement Saccharomyces cerevisiae en est incapable. Elle ne sait que convertir le xylose en xylitol sans le convertir en biomasse ou en éthanol.
On sait transformer S.cerevisiae pour une utilisation du xylose (mais aussi de l'arabinose), mais en aérobiose, ce qui va donner de la biomasse, mais pas d'éthanol. Beaucoup de bactéries en sont capables, mais utilisent le xylose de façon différente par rapport aux eucaryotes (elles utilisent le xylose en le convertissant en xylulose grâce à une xylose isomérase, tandis que les eucaryotes utilisent deux réactions redox successives passant par le xylitol).
Partant de la souche TMB3001 recombinante de S.cerevisiae qui surexprime la voie d'utilisation du xylose d'une autre levure, Pichia stipitis, des chercheurs de l'ETH de Zürich ont obtenu, après une très longue sélection, des levures capables d'utiliser le xylose, d'abord en aérobiose puis en anaérobiose. La conversion en xylulose cause un déséquilibre redox en anaérobiose et les mêmes auteurs ont isolé un mutant (C1) de TMB3001 capable d'utiliser les pentoses en anaérobiose (voir le Bulletin de Juin §133).
Le même groupe compare, maintenant huit souches transformées un peu différentes pour leurs performances et leur robustesse sur un mélange glucose/xylose ou sur un hydrolysat lignocellulosique. Les souches polyploïdes industrielles transformées de la même façon utilisent plus vite le xylose et résistent mieux aux hydrolysats lignocellulosiques que les souches de laboratoire. Mais les souches industrielles accumulent jusqu'à 30% plus de xylitol, ce qui fait autant de moins d'éthanol.
Les trois souches les plus performantes ont alors été mutées puis à nouveau sélectionnées, et les gagnantes dans ce sweepstake sont : la consommatrice la plus performante de xylose est TMB 3400, la productrice du plus haut titre en éthanol est la souche C5 et, de loin, la plus robuste face aux hydrolysats lignocellulosiques est la souche industrielle transformée F12. M Sonderegger et al.; Biotechnology & Bioengineering 87 (05JUL04) 90-98.
Les chercheurs de VTT Biotechnology montrent qu'il existe cependant, un système endogène d'utilisation du xylose chez Saccharomyces cerevisiae. MH Toivari et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3681-3686. Il suffit de surexprimer les seuls gènes GRE3 (YHR104w, codant une aldose réductase non spécifique impliquée dans le métabolisme du méthylglyoxal, du D-xylose et de l'arabinose) et XYL2 (YLR070c, ScXYL, codant une xylitol déshydrogénase pour le révéler. es
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86. Il est possible de piloter la production et la sécrétion de pyruvate par un Bacillus megaterium recombinant surproducteur (27 g/L.) en jouant sur les conditions de culture. Une culture placée en conditions de croissance lente n'en produit pas et ce n'est que quand on l'accélère en dopant le milieu en glucose qu'a lieu la surproduction. R Holmann et al.; Journal of Biotechnology 111 (01JUL04) 89-96. Ceci est dû au fait qu'il y a discordance, en excès de glucose, entre débit de la glycolyse et ceux de la pyruvate déshydrogénase plus le cycle tricarboxylique qui, normalement le consomment. Mais la croissance se ralentit, car le transporteur de glucose (un système PTS) est alors inhibé.
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87. La production de tréhalose (un disaccharide aux multiples usages) dans Corynebacterium glutamicum est étudiée par L Padilla et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUL04) 3845-3854. Cette bactérie la réalise par deux voies majeures, celle commandée par l'opéron OtsBA codant une tréhalose-6-phosphate synthase (OtsA) et une tréhalose-6-phosphate phosphatase (OtsB) et la voie TreYZ avec malto-oligosyltréhalose synthase et malto-oligosyltréhalose tréhalohydrolase, utilisant respectivement UDP-glucose et ADP-glucose, comme donneurs de glucose.
Une amélioration nette de la fourniture d'UDP-glucose peut être réalisée en exprimant l'UDP-glucose pyrophosphorylase d'Escherichia coli, éventuellement complétée par celle d'un opéron synthétique galU otsBA d'E. coli. L'analyse des résultats montre que l'UDP-glucose joue un rôle important, non seulement dans la voie OtsBA mais également dans la voie TreYZ.
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88. On sait que les Geobacter (voisins des Desulfovibrio, si je ne me trompe) sont capables de transférer directement des électrons à une anode. Des chercheurs de University of Massachusetts, Amherst, qui ont déjà travaillé sur les transferts à l'anode (DR Bond et al.; Science 295 (18JAN02) 483-485) se sont posé la question de savoir s'il était possible de faire servir une cathode comme fournisseur d'électrons pour des réductions comme dans la respiration sur nitrate. Une culture pure de Geobacter metallireducens réduit, dans ces conditions, nitrate en nitrite. Geobacter sulfurreducens réduit, également, fumarate en succinate. Mais comme dans les publications précédentes du groupe, il faut que les bactéries se fixent sur l'électrode en graphite. KB Gregory et al.; Environmental Microbiology 6 (JUN04) 596-604.
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90. Des chercheurs d'Oregon State University décrivent un nouveau groupe de bactéries marines (Lentisphaerées) dont une espèce, qu'ils ont dénommé Lentisphaera araneosa, produit un exo-polymère transparent. JC Cho et al.; Environmental Microbiology 6 (JUN04) 611-621.
Une analyse phylogénique les place au voisinage des Victivallis et constituent un nouveau phylum bactérien.
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91. S Gruenewald et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3282-3291 ont fait produire des peptides artificiels à synthèse non ribosomale à Escherichia coli en y exprimant des peptide-synthases. Ces enzymes, dont chacun des modules ne sait ajouter qu'un seul acide aminé, mais qui sont disposées en chaîne sous forme de domaines successifs ou d'enzymes greffées en série sur un squelette, sont utilisées par des microorganismes pour synthétiser des antibiotiques, par exemple. On peut donc monter des chaînes de production de n'importe quel oligopeptide en combinant les domaines ou enzymes et leur ordre. .
Ils ont ainsi obtenu le peptide cyclique Phe-Pro dicétopiperazine qui est ensuite sécrété sans aucune autre intervention, en se basant sur l'enzyme de production de la tyrocidine.
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92. Des chercheurs de Pohang en Corée ont exprimé chez Escherichia coli l'une des protéines adhésives du byssus de la moule Mytilus galloprovincialis, Mgfp-5. DS Hwang et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3352-3359.
La production de ces protéines n'est pas facile. Au début des années 90, Allied-Signal, avait essayé une production dans des E.coli recombinantes. Le motif de ces protéines consiste, en effet, en des répétitions de six ou dix aminoacides, alors que 5 acides aminés représentent 90% de la séquence, et ces protéines contiennent beaucoup de 3,4-dihydroxyphényl- L-alanine. Enfin le codage de ces acides aminés fait intervenir des codons différents de ceux des organismes de production usuels. Mais devant les difficultés, on était passé à la synthèse chimique en phase solide (essayée par BioPolymer), ce qui n'est pas commercialement viable. La marine américaine avait encouragé la bioproduction, à l'époque par Genex.
Actuellement c'est toujours l'extrait Cell-TakTM de byssus de la moule Mytilus edulis de Becton Dickinson Japan qui est commercialisé pour des recherches (adhésion de cellules ou molécules sur des surfaces). Mais il faut réaliser qu'il faut 10 000 byssus pour extraire 1 mg de la protéine.
Entre temps on commence à mieux connaître ces protéines et leurs propriétés individuelles ainsi que les
acides aminés les plus importants pour la fonction d'adhésion. Les plaques adhésives du byssus comprennent au moins six protéines différentes où la 3,4-dihydroxyphénylalanine représente entre 0,1 et 30%. La distribution de ces protéines, chez la moule M.edulis, indique que ce sont mefp-3 (20 mol %) et mefp-5 (30 mol %), qui abondent à l'interface entre la plaque et le substrat physique.
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93. ### Il n'est pas si facile que cela de modifier des voies métaboliques, car les entrées possibles dans ces circuits sont très nombreuses, et on a du mal à prévoir ce qui se passerait si on agissait sur une seule.
On a, traditionnellement, utilisé les dérégulations pour surmonter la résistance des circuits métaboliques (voir la stratégie pour améliorer la production de lysine; par exemple). Plus récemment, on a monté des circuits régulateurs synthétiques pour reprogrammer la transcription, le métabolisme ou la communication. Ces circuits utilisent les composants normaux, mais en modifiant leur connectivité pour assurer une fonction. Ces stratégies ont cependant une limite avec les éléments disponibles.
Deux articles décrivent comment attaquer ce problème avec des réseaux pour vérifier l'effet de ces modulations artificielles. (GY Jung et al.; Science 304 (12APR04) 428-431 et FJ Isaacs et al.; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 841–847) commentés par JC Liao; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 803-804.
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Les Protéines et les Enzymes
94. Les intéines sont des peptides capables de s'exciser de protéines (comme les introns des prémessagers), et dont le mécanisme d'épissage autocatalytique permet une religation des peptides flanquants. On en connaît plus de 170, cataloguées dans la base Inbase (www.neb.com/inteins) L'épissage des intéines est un système faisant intervenir plusieurs facteurs cellulaires, ce qui en fait un système "portable" dans des systèmes cellulaires différents. Mais les intéines sont plus ou moins sensibles aux séquences flanquantes de la protéine porteuse. L'effet de position dans des contextes hétérologues peut être levé en essayant plusieurs sites d'insertion de l'intéine.
MP Zeidler et al.; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 871–876 ont contourné cet obstacle en combinant une intéine thermosensible (celle de l'ATPase vacuolaire VMA) avec les facteurs de transcription Gal4 et Gal80 de la levure. Un simple choc thermique provoque l'excision de l'intéine hors du facteur de transcription chimérique, restaurant ainsi sa fonction. Gal4 est un activateur très utilisé en transgenèse, notamment chez la Drosophile ou plus de 7000 lignées sont référencées dans la base GETDB (Gal4 Enhancer Trap Insertion Database à flymap.lab.nig.ac.jp/~dclust/getdb.html. Gal80 bloque cette activation de la transcription en se liant à Gal4. MP Zeidler et al. ont appliqué cette technique à la levure pour vérifier son efficacité, puis à des cellules de Drosophile et enfin à des disques imaginaux. Voir également le commentaire de FB Perler; p.824-826.
Parmi les signataires ont trouve un chercheur passé chez Amgen et un autre de l'Institut Curie.
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95. ### Des mutations ont continuellement lieu, et sont un substrat de l'évolution. L'amélioration des enzymes a longtemps reposé sur la sélection de variants issus de cette évolution, puis par des mutations induites. Tout ceci repose sur le hasard. Pour sélectionner, il faut un phénotype. Mais une protéine dont la séquence génique a été modifiée (même des mutations non synonymes) n'a pas forcément un phénotype que l'on puisse cribler.
C'est à la tolérance des protéines aux modifications ainsi induites, et se traduisant, dans le cas contraire, à une inactivation qu'est consacré un article de HH Guo et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (22JUN04) 9205-9210..
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96. Le criblage des bibliothèques de mutants pour surveiller une évolution in vitro d'enzymes implique usuellement une séparation des cellules productrices pour les évaluer individuellement au sein de clones, ce qui est lourd. Ceci limite l'exploitation globale du potentiel réelle de ces bibliothèques. A Freeman et al.; Biotechnology & Bioengineering 86 (20APR04) 196-200 décrivent une technique permettant de cribler une population de 106 à 107 clones avec des essais enzymatiques multiples.
Ils immobilisent les cellules sur des billes d'acrylamide équilibrées avec le milieu de culture à raison d'une par bille. Les billes avec une (ou pas de cellule) sont ensuite immobilisées sur un support de verre. Les cellules prolifèrent sur les billes en un clone que l'on peut alors cribler an les confrontant avec des substrats chromogènes ou fluorescents successifs.
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97. On trouvera dans BD Moore; Trends in Plant Science 9 (MAY04) 221-228, une revue sur des enzymes multifonctionnelles. Une enzyme bifonctionnelle est constituée, par exemple, de deux domaines enzymatiquement différents assurant, par exemple, deux étapes successives dans une voie métabolique, ce qui assure le couplage entre ces étapes. Un cas plus subtil est celui des enzymes travaillant au noir avec une fonction principale, plus une autre fonction, structurale ou régulatrice. La revue est consacrée aux enzymes de ces deux types chez les plantes, mais qui a des implications plus générales aux eucaryotes, car l'auteur s'attache à montrer comment ces structures permettent des régulations fines.
Une protéine est généralement multidomaines, et donc constituée de modules. On connaît actuellement environ 50 000 de ces domaines (voir http://scop.berkeley.edu/ ; scop signifiant Structural Classification Of Proteins).
Certaines enzymes dites "simples" peuvent exprimer plusieurs fonctions et de différentes façons dans divers tissus. Ainsi la phosphoenolpyruvate carboxylase intervient dans la photosynthèse en C4 dans les feuilles et participe à la nodulation dans les racines. Certaines de ces enzymes sont laxistes en ce qui concerne leurs substrats, ainsi l'aldolase chloroplastique clive aussi bien le sédoheptulose-1,7-bisphosphate que le fructose-1,6-bisphosphate. On connaît bien le cas des nombreux cytochrome P450 mono-oxygénases et de certaines désaturases d'acides gras qui peuvent donner plusieurs produits à partir d'un même substrat.
Le cas probablement le plus intéressant est bien celui des enzymes assurant deux fonctions très différentes grâce à deux sites actifs distincts évoqué plus haut.
Mais l'auteur déduit d'un examen des données publiées que la bifonctionnalité n'est pas un phénomène généralisé, car il n'en a détecté que 23 exemples clairs. Cela signifie que ces cas sont des adaptations à des situations particulières. Ce sont souvent des enzymes situées à des bifurcations de voies métaboliques, mais la plupart de ces bifurcations sont parfaitement assurées par des enzymes monospécifiques et l'avantage sélectif ne doit pas être extraordinaire.
De plus l'architecture du génome permet parfois d'exprimer à la fois la version bifonctionnelle de l'enzyme et la version monofonctionnelle. C'est le cas de la lysine-cétoglutarateréductase–saccharopine-déshydrogénase (LKR–SDH) qui catalyse les deux premières étapes de la dégradation de la lysine, avec le transfert du groupe eð-amino de la lysine sur le 2-oxoglutarate. On observe cette situation quand il y a de gros besoins d'acétyl-CoA. Chez certaines espèces, dont Arabidopsis, la LKR SDH est codée par un locus composite avec un promoteur interne qui permet une expression alternative des formes bi- et monofonctionnelles avec un et des sites de polyadénylation internes donnant des LKRs monofonctionnelles.
L'aspartate-kinase–homosérine-déhydrogénase (AK–HSDH) intervient dans la synthèse de la méthionine et de la thréonine, donnant de l'aspartate-4-phosphate au cours de la détermination vers la voie homosérine et à la bifurcation vers la méthionine. AK–HSDH contient quatre domaines dont deux sont régulateurs et reconnaissent les acides aminés impliquées dans les régulations en retour (l'excès entraîne une inhibition de la voie de synthèse). Il existe, cependant une aspartate-kinase monofonctionnelle chez les plantes, et elle est inhibée par la lysine qui est également synthétisée via l'aspartate semialdéhyde. Ceci permet une partition différentielle du carbone entre ces trois voies. On trouve une situation un peu comparable pour la dihydrofolate-réductase–thymidylate-synthase.
La ferredoxine:sulfite réductase (Fd-SiR) chloroplastique du pois est un exemple d'enzymes travaillant "au noir". Elle a bien une activité de réductase, mais intervient également dans le compactage de l'ADN chloroplastique. Dans le cas du facteur d'élongation des eucaryotes eEF-1A, on a bien une fonction dans la traduction mais également joue un rôle dans la manipulation du cytosquelette découpant les microtubules. Mais elle est aussi dotée de deux sites liant l'actine. Les modifications post-traductionnelles abondantes lui permettent d'assurer d'autres fonctions.
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98. Des chercheurs catalans ont cloné et caractérisé une xylanase A de 24kDa d'un Bacillus (la souche BP-7). Elle est particulièrement efficace sur les xylanes des bois de feuillus et sur les céréales. Son activité maximale s'observe à pH 6 et 60°. Elle est fortement inhibée par les ions Mn2+, Fe3+, Pb2+, et Hg2+. O Gallardo et al.; Current Microbiology 48 (APR04) 276-279.
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99. Les interfaces avec les gouttelettes organiques ou la surface des bulles (même d'air) ont un effet déstabilisant sur les enzymes solubles. On cherche donc à gainer les molécules d'enzymes avec une couche hydrophile. Des chercheurs espagnols l'ont fait avec des dextrane-aldehydes. L Betancor et al.; Journal of Biotechnology 110 (27MAY04) 201-207.
Après optimisation la taille des dextranes qui semble jouer un grand rôle, les auteurs ont conjugué glucose oxydase, D-aminoacide oxydase et trypsine avec le dextrane aldéhyde. L'effet protecteur est net.
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101. Une aminopeptidase psychrophile de la famille M1 de la bactérie marine Colwellia psychrerythraea est décrite par AL Huston et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3321-3328. Les Colwiella sont des bactéries aéro-anaérobies, psychrophiles (isolées des régions polaires) et parfois barophiles (on les trouve dans les eaux profondes à 4°C des océans) qui sont voisines des Alteromonas. La Topt de l'enzyme est de 19°C et elle est relativement thermolabile. La bande de pH où elle est active est étroite (pH 6,0 à 8,5).
On peut améliorer la stabilité de l'enzyme en présence d'exopolysaccharides produits par la bactérie.
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102. Les pullulanases (pullulane 6-glucanohydrolase) sont des enzymes déramifiantes des glucanes, dont les liaisons að-1,6 du glucane linéaire qu'est le pullulane, donnant du maltotriose
On divise les pullulanases en deux classes : les types I ou enzymes déramifiantes, s'attaquant aux liaisons að-1,6 des oligosaccharides, ramifiés donnant des oligomères linéaires að-1,4 et les types II clivant les liaisons að-1,6 du pullulane et autres glucanes ramifiés en sus des liaisons að-1,4 .
Du fait de leur intérêt dans les conversions industrielles des amidons on en a isolé d'assez nombreuses versions. Mais, dans ce but, il faut qu'elle soient thermostables pour être utiles. On les a donc isolées de microorganismes thermophiles (surtout des archées). Ces enzymes sont surtout actives à pHs acides ou neutre. On en connaît qui sont alcaliphiles, mais la plupart ne sont pas classées dans le type I car ce sont des enzymes bifonctionnelles (voir §97) ayant deux sites actifs, l'un amylasique et l'autre pullulanasique. Les seules alcaliphiles sont également mésophiles (températures moyennes) et ne sont pas intéressantes sur le plan industriel.
Anaerobranca gottschalkii DSM 13577 est une anaérobie obligatoire que l'on isolé en 2001 d'une source chaude d'un lac du Kenya. Elle est thermoalcaliphile et se nourrit de polysaccharides à pH9 et 55°. Son génome a été entièrement séquencé en 2002 et on y a découvert un gène qui est certainement un gène de pullulanase alors qu'on n'avait pas pu caractériser d'enzyme de ce type.
Les découvreurs de la bactérie on cloné le gène et l'ont exprimé dans Escherichia coli. Il semble exister deux isoformes de l'enzyme l'une complète et l'autre tronquée. C Bertoldo et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3407-3416. L'enzyme a une Topt de 70°C à pH 8,0. L'enzyme donne du maltotriose comme produit final à partir d'amylopectine, amidon, bð-limite dextrines et glycogène mais pas de l'amylose.
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104. Des chercheurs coréens ont caractérisé le gène d'une glucoamylase thermostable de l'archée hyperthermophile Sulfolobus solfataricus (ssg). MS Kim et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUL04) 3933-3940. Exprimé chez Escherichia coli les propriétés de l'enzyme ont été établies. L'enzyme est organisé en tétramère. Elle est très thermostable et sa Topt est de 90° et son pHopt est dans la fourchette 5,5 à 6,0, c qui en fait une enzyme bien adaptée à la production de sirops de glucose à partir de l'amidon, évitant d'avoir à ajuster pH et température dans la chaîne des conversions. Elle a pour substrat préféré le maltotriose (celui qui résulte de l'activité des pullulanases).
On a cloné plusieurs að-amylases très thermoactives à partir d'archées hyperthermophiles comme Sulfolobus, Pyrococcus, et Thermococcus, mais les glucoamylases sont très rares chez les archées.
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L'Agroalimentaire
105. ### La mise en œuvre industrielle des enzymes (ou de cellules actives) peut aboutiir à des déboires avec une persistance non souhaitée des effets. On ne peut donc se limiter à l'identification de microorganismes ou d'enzymes (naturelles ou perfectionnées) ayant une activité donnée, ou à leur simple immobilisation. Il faut se préoccuper des différents inhibiteurs potentiels ou démontrés, les protecteurs (chaperones par exemple). A Wiseman et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAY04) 276-279 se penche sur cette question des développements potentiels dans une utilisation intégrée des enzymes dans l'industrie agro-alimentaire.
Les enzymes ne résistent pas bien aux traitements intermédiaires dans une fabrication, comme le chauffage à hautes températures. Enfin, il est difficile d'envisager des opérations multienzymatiques qui posent des problèmes d'incompatibilité de température et de pH optimaux qui comporteraient obligatoirement des modifications répétées de contexte physicochimiques qui sont, certes, possibles mais coûteuses. Ajoutez le fait que l'opération ne peut être simultanée du fait des activités spécifiques incompatibles entre les différentes enzymes (il y a forcément une enzyme qui va être limitante de ce point de vue). Il faudra, alors utiliser des doses d'enzymes variables selon l'activité. Mais les modifications dirigées des enzymes permettent de rapprocher chacune d'entre elle des desiderata de l'ingénieur.
L'immobilisation d'une enzyme est séduisante pour le maintien de l'activité, mais elle a un prix: le Km (en gros l'affinité) est augmenté (et l'affinité diminuée), tandis que le kcat (l'activité) est abaissé dans la plupart des cas d'immobilisation, pour des raisons de diffusion limitée des molécules. Il faut alors modifier le support, l'enzyme et le procédé.
On peut, dans certains cas tourner ces obstacles en pontant astucieusement les enzymes pour conserver la stabilisation et en ajustant les conditions d'utilisation.
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106. Kluyveromyces thermotolerans a du mal à coexister en cultures mixtes avec Saccharomyces cerevisiae, alors que Torulaspora delbrueckii (qui est utilisée dans les bières de blé) en est relativement capable. Ceci a été expliqué par le fait que les capacités de transport du glucose sont défavorables pour ces levures par rapport à S.cerevisiae. Cette capacité dépend, de plus, de la concentration d'oxygène, plus il y en a plus ces deux levures ont des chances de survivre. P Nissen et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 64 (MAY04) 543-550.
Ces deux levures font, respectivement partie des ferments .Symphony"! (S.cerevisiae et Kluyveromyces thermotolerans) et Harmony"! (les trois levures) de Christian Hansen qui viennent d'être mis sur le marché et sont destinés à améliorer les arômes des vins.
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108. Trois groupes de phages lactococcaux distincts sont isolés régulièrement des fermentations laitières avortées: les phages 936, c2 et P335. Pourtant les Lactococcus lactis disposent d'une cinquantaine de mécanismes de défenses différents, classés en quatre groupes suivant la phase du cycle viral qu'ils ciblent: adsorption; libération de l'ADN phagique, sa destruction par restriction, et ce que l'on appelle de façon vague les infections abortives (comme si les autres n'en étaient pas), mais qui en réalité conduisent à une mort cellulaire ce qui évite la généralisation de l'infection. On connaît plus de 20 de ces derniers systèmes hétéroclites dits Abi (Abortive infection).
En présence de ces systèmes, il y a une forte pression de sélection pour un évitement. Les phages en ont développé deux types. Le premier n'est rencontré que chez les phages du groupe P335 et résultent d'une recombinaison entre le phage et des séquences apparentées dans le chromosome bactérien. De tels mutants ne sont actuellement connus que dans le cas des systèmes AbiA, AbiC, AbiK et AbiT. Le second est présent dans les trois groupes de phages et consiste en mutations ponctuelles. On a, ainsi, pu identifier les éléments du phage sensibles à ces résistances de type Abi grâce à deux mutations ponctuelles, rendant insensibles à la résistance le phage Fð31 (groupe P335) à AbiA dans la région intergénique de l'orf245 du bactériophage. D'un autre côté, l'efficacité d'AbiD1est accrue par l'expression de l'orf1 normale du phage bIL66 (groupe 936).
Des chercheurs canadiens viennent de caractériser dix mutants ponctuels de résistance à AbiK. JD Bouchard et al.; Journal of Bacteriology 186,n°11 (JUN04) 3649-3652.
Les gèns mutés sont placés au même endroit dans le chromosome phagique, mais les protéines codées sont très différentes. Quatre protéines différentes impliquées dans la sensibilité à AbiK (Sak) ont ainsi été identifiées. Deux d'entre elles sont apparentées à Erf et RAD52, qui sont deux protéines se fixant sur les ADN simples brins et impliquées dans la recombinaison.
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109. Les agrumes n'ont, en principe, pas de fruit climactérique (avec un rôle important et auto-entretenu, de l'éthylène dans la maturation). Il n'y a qu'une très faible émission d'éthylène lors de cette maturation, ce qui ne signifie pas que l'éthylène n'y a pas un rôle. L'addition d'éthylène modifie la pigmentation du fruit qui y est donc sensible. Des chercheurs israéliens (E Katz et al.; Planta 219 (JUN04) 243-252) montrent que les jeunes fruits sur l'arbre produisent une forte quantité d'éthylène, mais cette production cesse, précisément, au moment de la maturation. A la récolte on a une bouffée d'éthylène de type climactérique avec induction des gènes d'1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) synthase 1 (ACS1), ACC oxydase 1 (ACO1) et du récepteur de l'éthylène ETR1. Cette induction est accélérée et renforcée par de l'éthylène ou du propylène, indiquant un système autocatalytique qui ressemble au système II. Dans des fruits mûrs, on n'a plus qu'une faible expression de l'ACC synthase 2 (ACS2) et du récepteur de l'éthylène ETR1 (système 1). A ce stade on ne peut plus stimuler l'expression de ces gènes par une addition d'éthylène exogène.
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Les Pré et Probiotiques et Autres
110. Les probiotiques bactériens sont utilisables pour stimuler les cellules dendritiques de l'intestin. Ces cellules présentatrices d'antigènes aux cellules effectrices T sont chargées de surveiller la composition de la microflore intestinale et déclencher les réponses immunitaires. M Drakes et al.; Infection & Immunity 72 (JUN04) 3299-3309 ont étudié cette capacité pour un cocktail commercial. De fortes doses de ce probiotique stimule l'expression des CD80 (alias B7.1), CD86 (alias B7.2), CD40, qui sont des co-stimulateurs de l'activation des cellules T, et des MHC-II. Les études fonctionnelles montrent que le probiotique n'augmente pas la capacité des cellules dendritiques à induire la prolifération des cellules T allogénéiques, comme c'est le cas pour Escherichia coli. On observe, cependant, une production accrue d'interleukine-10 après trois jours de stimulation par le probiotique, et c'est probablement l'explication des effets probiotiques décrits dans la littérature.
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111. On trouvera une revue sur les lactobacilles par GW Tannock; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3189–3194.
On en connaît environ 80 espèces. Toutes, comme les bactéries lactiques dans leur ensemble, sont des espèces fermentaires aérotolérantes résistant bien à l'acidité. Elles son inféodées aux milieux d'origine biologiques à cause de leurs exigences nutritionnelles complexes. Leur fermentation du glucose donne, pour certains, presqu'exclusivement de l'acide lactique (homofermentaires) , alors que pour d'autres on a une production d'acide lactique mais aussi acétique, éthanol et surtout de C02 (hétérofermentaires) ce qui engendrer la formation du bulles dans le matériel fermenté.
Ces lactobacilles sont présents dans de nombreux aliments qui ont besoin d'être acidifiés pour leur conservation, commes produits laitiers, certes, mais aussi de végétaux (olives, "pickles" et choucroûte) carnés avec les saucisses et saucissons et enfin boulangers avec le pain de campagne. Enfin ce sont des habitants du tube digestif des animaux et on leur à attribué des propriétés probiotiques dans l'élimination des producteurs de substances toxiques (Metchnikoff leur attribuait le vieillissement et ne recommandait pas moins que l'ablation totale du gros intestin!!!!). Mais le même prix Nobel a recommandé la modification de la flore par son bacille "bulgare" provenant des yaourts bulgares qui confèrerait longue vie. On entre ainsi dans le domaine des probiotiques qui ont eu une signification évolutive au cours du temps depuis la première citation de 1965.
Comme ces produits sont maintenant largement commercialisés, car ils ne sont pas soumis aux mêmes essais rigoureux que les vrais médicaments car la seule exigence est de ne pas être toxique.
L'auteur insiste sur le fait que l'homéostasie microbienne des tubes digestifs est un mécanisme extrement puissant qui ne laisse que peu d'opportunité à des introductions accidentelles (ou délibérées). Les bactéries allochtones provenant de notre alimentation n'ont donc qu'une présence transitoire dans l'intestin. Il faut donc continuellement réingérer une flore bénéficielle ce qui fait, évidemment, le bonheur des fabricants.
On a étudié l'établissement et le maintien de la flore qui s'installe dès la naissance notamment chez les poussins en élevages industriels. Au moins certains des lactobacilles adhère à la paroi du gésier et y constituent un biofilm.
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La sécurité alimentaire
112. Salmonella enterica ssp enterica serovar Enteritidis est la cause principale des infections humaines d'origine aviaire par le biais des œufs en Europe et aux Etats-Unis. Ces infections progressent en Extrême Orient depuis quelques années.
Elle possède manifestement des structures lui permettant de persister dans le tractus génital de la poule. D'autres sérovars de S.enterica (Gallinarum et Pullorum), sont très répandus chez les poules pondeuses mais n'ont que rarement infecté l'homme.
S Enteridis est, cependant, incapable de se multiplier dans du blanc d'œuf frais. Elle doit avoir accès au jaune d'œuf. Et pourtant elle colonise facilement en 21 jours environ 7% des œufs à l'étalage. Une des façons recommandées de diminuer l'occurrence de ces infections est de stocker les œufs à plus basse température. Ceci peut être expliqué par le fait que la membrane vitelline, qui sépare le blanc du jaune, est riche en collagène et entourée d'une couche de glycoprotéines. Le glucose du blanc d'œuf réagit avec ces protéines augmentant progressivement la perméabilité de cette membrane durant le stockage à température au dessus de 6°. Ceci libère des constituants du jaune qui vont permettre l'invasion par la bactérie après environ 21 jours à 20°.
L'adhérence à la membrane vitelline et sa pénétration sont probablement facilitée chez Salmonella enterica ssp enterica serovar Enteritidis par l'un des multiples appendices productibles par la bactérie.
Salmonella enterica est capable de produire de nombreuses structures de surface dont les fimbriae de type I (SEF21), les curli fimbriae (SEF17), SEF14, les longues fimbriae polaires (LPF) et celles codées par des plasmides, ainsi que des flagelles. Beaucoup de ces superstructures sont nécessaires au processus infectieux, et notamment à la colonisation du tractus génital de la poule
Les fimbriae SEF14 ne sont présentes que dans un groupe restreint de sérovar D et facilite cette adhérence au tractus génital. Les flagelles sont apparemment nécessaires à l'invasion de tissus internes. Les fimbriae de type I et les fimbriae curli d'Escherichia coli, analogues à SEF21 et SEF17 de S.Enteritidis, sont associés à la persistance initiale dans le tractus gastro-intestinal aviaire.
Les infections humaines ayant cette origine impliquent surtout le sérovar Enteritidis colonisées par le phage type 4. Les souches de Salmonella.Enteritidis dépourvues de flagelles sont incapables de se multiplier dans l'œuf de poule. Celles dépourvues des curli fimbriae, dont celle du type phagique PT6, présentent une forte prolifération dans certains œufs, mais nettement moins que celles qui sont pourvues de ces fimbriae. TA Cogan et al.; Microbiology 150, (APR04) 1063–1071.
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113. L'entérotoxine RTX de Vibrio cholerae est décelable par l'arrondissement et le détachement des cellules HEp-2 (une lignée de cellules épithéliales laryngiennes humaines). Ceci est apparemment lié à la dépolymérisation de fibres d'actines par pontage covalent de l'actine. On vient d'identifier le domaine de RTX qui assure ce pontage. KL Sheahan et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (29JUN04) 9798-9803. Mais l'arrondissement des cellules n'est pas supprimé quand on élimine ce domaine, ce qui indique des mécanismes d'action multiples de cette entérotoxine.
Ce qui est intéressant est qu'il existe une autre séquence codant une protéine ayant cette propriété de ponter l'actine et qu'on peut rétablir l'effet de pontage dans les toxines tronquées précédentes. Il y a manifestement eu une acquisition horizontale de ce domaine qui s'est ensuite intégré à l'entérotoxine.
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114. Vibrio cholerae possède un unique flagelle polaire gainé. La production de ce flagelle, la motilité et la chimiotaxie qui oriente les déplacements sont associées à la virulence. La bactérie exprime les gènes flagellaires grâce aux facteurs de transcription sð54 et sð28. Chez d'autres bactéries, l'activité transcriptionnelle de sð28 est régulée par un facteur anti-sð28, FlgM.
NE Correa et al.; Journal of Bacteriology 186,n°14 (JUL04) 4613-4619 viennent de montrer que l'homologue de FlgM de V. cholerae interagît avec sð28, qu'il bloque dans le cas de certains des promoteurs sð28-dépendant de V.cholerae ðet qu'il est sécrétée au niveau de la gaine du flagelle. FlgM n'a, en effet, pas un effet répresseur uniforme sur tous les promoteurs sð28-dépendants.
FlgM est donc bien un facteur anti-sð28 et le flagelle est un appareil de sécrétion de protéines non structurales. Mais à quoi cela peut-il servir?
FliA code sð28 et son absence empêche la transcription de flaB, flaC, flaD et flaE et produisent un flagelle tronqué lié à l'assemblage de la seule sous-unité FlaA. La flagelline codée par le gène flaA sð54-dépendant est indispensable à la synthèse du flagelle de V. cholerae, tandis que celle des flagellines FlaB, FlaC, FlaD et FlaE est sð28-dépendante et elle est moins indispensable. Voir également le commentaire de DM Heithoff et al.; Journal of Bacteriology 186,n°15 (AUG04) 4835-4837.
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115. Le moteur flagellaire, alimenté par un gradient de Na+ de Vibrio cholerae régule négativement la production des exopolysaccharides nécessaires à la formation de ses biofilms, dont les deux groupes de gènes vps sont responsables. CM Lauriano et al.; Journal of Bacteriology 186,n°15 (AUG04) 4864-4874. Le biofilm semble être la forme de persistance dans l'environnement saumâtre naturel.
Le phénotype rugueux FlaA-, lié à la formation du biofilm, ressemble à un phénomène de variation de phase. On peut retourner au phénotype lisse par une seconde mutation.
Des mutations des gènes codant le moteur alimenté par le gradient de sodium (mot) dans une souche nonflagellée réduit l'expression de l'EPS, la formation du biofilm et la transcription du gène vps. Le gène vpsR code un régulateur de réponse, qui réduit l'expression des EPS, la formation de biofilm et la transcription du gène vps chez les cellules non flagellées. La complémentation de souches mutantes vpsR par un gène à expression permanente restaure l'ensemble du phénotype.
La régulation de cette interaction entre flagelle et biofilm est bien complexe et les auteurs constatent que le moteur flagellaire et la forme active de VpsR (probablement la forme phosphorylée) jouent un rôle dans la transduction du signal conduisant à l'expression d'EPS. Cette expression empêche la colonisation de l'intestin. Et la production de la toxine cholérique et le pilus co-exprimé. L'élimination des EPS est un facteur de virulence.
Le moteur flagellaire est donc intimement associé à l'expression de ce phénotype et à la virulence de V.cholerae. La cascade de signaux liés à non seulement la production d'EPS mais probablement à plusieurs autres réponses à l'environnement opère à partir d'un capteur mécanosenseur flagellaire
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116. L'intestin humain dispose d'une batterie de peptides antimicrobiens intervenant dans les défenses innées. Le BPI (Bactericidal/Permeability-Increasing) intervient ainsi contre les Gram-. C'est une protéine cationique de 60-kDa exprimée à la surface des épithéliums gastro-intestinaux. BPI se lie à la partie lipide A des lipopolysaccharides (LPS). Sa fonction antibactérienne dépend de régions différentes de la protéine. La porine OmpU de Vibrio cholerae, dont la production est régulée par le régulateur maître de la pathogénicité de la bactérie, ToxR, confère une résistance au BPI, plus particulièrement à un fragment particulier de ce peptide. J Mathur et al.; Infection & Immunity 72 (JUN04) 3577-3583.
Chez d'autres bactéries comme Escherichia coli et Salmonella enterica serovar Typhimurium, la résistance à ce peptide est liée à l'activité d'une GTPase.
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116bis.Il existe sept neurotoxines de Clostridium botulinum antigéniquement distinctes (types A à G). La neurotoxine (NTX, d'environ150 kDa) est sous forme d'un complexe stable où elle est associée à des protéines non toxiques.Ce complexe est présent sous trois formes possibles: la toxine 12S (~300 kDa), 16S (~500 kDa) et 19S (~900 kDa).
Si la toxine de type A présente ces trois formes, les neurotoxines des types B, C et D ne présentent que deux formes 16S et 12S. Les types E et F ne présentent que la forme 12S, alors que la toxine de type G que la forme 16S.
Le complexe 12S ne comporte que la toxine NTX associée à une seule protéine non toxique et non hémagglutinante (NTNH). Le complexe 16S comporte NTX, la protéine NTNH et une hémagglutinine (HA).
Le complexe 19S du type A a une composition identique à celle du complexe 16S. C'est en fait un dimère du complexe 16S conjugué via HA1.
NTX bloque spécifiquement la libération de l'acétylcholine en clivant des protéines permettant l'exocytose. Les autres protéines des complexes protègent la toxine au cours de ses pérégrinations.
HA intervient dans l'adhésion de la toxine aux entérocytes, ainsi qu'aux hématies. Dans le cas du type C cette fixation dépend de la présence de l'acide sialique. HA comporte quatre composants distincts, HA1, HA2, HA3a et HA3b.
La région C-terminale de HA3b est importante pour l'adhésion, via le sialosylparagloboside et HA1 par un autre site. Y Fujinaga et al.; Microbiology 150 (MAY04) 1529-1538.
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L'Environnement
117. La bromofuranone de la grande algue rouge Delisea pulchra [(5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone] inhibe la formation des biofilms de bactéries Gram+ en neutralisant probablement les signaux du "quorum sensing" (voir M Manefield et al.; Microbiology 148 (APR02) 1119-1123). Desulfotomaculum orientis est une bactérie sulfatoréductrice provoquant une corrosion des aciers doux. On peut limiter cette corrosion par une addition de ces furanones halogénées. Il suffit de 0,04 g/L. pour inhiber à 96% la corrosion.
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118.### L'hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX pour Royal Demolition Explosive, alias cyclonite) contamine tous les sites industriels où il a été fabriqué (et a été extrait des munitions périmées) et a diffusé grâce aux effluents généreusement distribués aux alentours.
On peut le dégrader de façon anaérobie avec des consortiums méthanogénes avec l'hydrogène pour seule source d'électrons. Le RDX a d'ailleurs un effet inhibiteur sur la méthanogenèse, augmentant cette production d'hydrogène. On vient d'identifier, dans ces consortiums, la souche homoacétogène HAAP-1, voisine d'Acetobacterium malicum et d'A.wieringae comme l'un des responsables de cette dégradation. NR Adrian et al.; Current Microbiology 48 (APR04) 332-340.
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119.### Des oxydoréductases flavines-dépendantes de la famille de l'Old Yellow Enzyme (qui catalysent un grand nombre de transformations) sont utilisables dans la destruction des explosifs nitrés. Les séquences génomiques indiquent que les enzymes de la famille sont présentes dans un grand nombre de bactéries, chez les plantes, en sus des levures. On n'a cependant pas pu prouver leur fonction, bien qu'elle soit très probablement conservée. Le pentaerythritol tétranitrate (PETN) est un explosif très puissant qui est plus sensible aux chocs ou à la friction que le TNT ou le tétryl. Il n'est jamais utilisé seul et, on l'incorpore dans des munitions de petit calibre, des détonateurs de certaines mines terrestres et c'est le coeur explosif du primacord d'Ensign-Bickford (producteur du cordon Bickford de bien des films guerriers).
La plupart des essais de bioremédiation du TNT porte sur la réduction des groupes nitro, dont les produits ont tendance à se fixer aux composants du sol, sans clivage du noyau aromatique, et il est difficile de repérer l'évolution de ces composés dans ces conditions.
L'enzyme assurant la libération de certains des groupes nitro (mais pas tous) du PETN est une PETN réductase NADH dépendante. Certaines de ces enzymes dégradent également le TNT (2,4,6-TriNitroToluène). RE Williams et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3566-3574 analysent les activités de cinq de ces nitrate-esters réductases et montrent que les activités sont différentes sur les différents explosifs (TNT, PETN et nitrolycérine) et qu'un explosif donné n'est pas un bon substrat pour les cinq. Le TNT est attaqué par ces enzymes, mais avec un enthousiasme limité.
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121.. On trouvera dans MY Galperin; Environmental Microbiology 6 (JUN04) 552-567 une revue sur les réseaux de signaux chez les bactéries, vus à travers une perspective génomique.
Ces signaux sont engendrés par les capteurs analysant les paramètres environnementaux et intracellulaires et n'ont de sens biologique qu'intégrés quelque part.
Les études comparatives permettent de révéler des tendances générales. La première consiste en une structure modulaire des protéines de signalisation. La seconde est la transmission du signal à partir du domaine capteur N-terminal vers le transmetteur C-terminal (signal output domain). La troisième est la conservation de l'utilisation des domaines sensitifs par différents récepteurs membranaires. La quatrième, chez certains organismes, est le captage d'un même signal environnemental par plusieurs circuits régulateurs. La cinquième est l'importance des messagers secondaires comme l'AMP cyclique et le diguanlylate cyclique. Enfin, les composants de voies différentes communiquent souvent entre eux.
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122. On sait que les plantes libèrent, au niveau racinaire, des enzymes capables de dégrader certains xénobiotiques. Des chercheurs chinois décrivent dans GD Wang et al.; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 893-897, l'élimination de trichlorophénol et autres phénoliques grâce à la surexpression dans les racines d'une laccase sécrétée du coton Gossypium arboreum dans Arabidopsis thaliana. Cette surexpression permet à la fois une résistance de la plante aux phénols et une transformation du trichlorophénol.
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123. Le plasmide classique pJP4 autotransmissible de 84 kb de Ralstonia eutropha JMP134 est porteur de plusieurs gènes impliqués dans la dégradation de substrats aromatiques substitués, les gènes tfd. La séquence complète du plasmide est publiée et analysée par N Trefault et al.; Environmental Microbiology 6 (JUL04) 655-668.
Les nouveautés dans ce génome consistent dans des gènes de transports de composés aromatiques et d'oxydation des acides gras à courtes chaînes. On y retrouve des éléments mobiles comme un transposon composite dérivant d'IS1071, plus le gène de résistance au mercure de Tn501. Ces éléments sont devenus incapables de transposer et situés dans une région du plasmide portant de nombreuses traces de transferts horizontaux. pJP4 est capable de capturer des gènes chromosomiques et de donner des hybrides avec un autre plasmide bien connu RP4.
On trouvera, par ailleurs, dans S Bathe et al.; FEMS Microbiology Letters 235 (15JUN04) 215-219, une étude sur le vagabondage de ce plasmide dans une communauté issue de boues activées de stations d'épuration de l'eau.
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124. La microflore permettant une dégradation de perchlorates dans des sites contaminés a été étudiée par des chercheurs canadiens (AS Waller et al.; Environmental Microbiology 6 (MAY04) 517-527).
Seize souches ont été caractérisées, et elles sont apparentées à des Dechloromonas (bð-protéobactéries) ou à des Azospirillum (að-protéobactéries). Le plus intéressant dans cette caractérisation, est le fait que les Azospirillum ont probablement été sous-estimés dans leurs capacités. Il semble que ces dernières soient plus efficaces aux faibles concentrations des perchlorates.
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125. J'ai décrit brièvement dans le Bulletin de Juillet 2003 §112 l'histoire du Rio Tinto qui est un fleuve (quand il y a de l'eau) très acide (pH2) et riche en métaux mais, de ce fait totalement abiotique. Il n'a pas fait la fortune du trésor royal d'Espagne qui voulait y trouver de l'or, mais a suscité la création de la compagnie minière du même nom.
AI Lopez-Archilla et al.; FEMS Microbiology Letters 235 (15JUN04) 221-228 y décrivent une communauté microbienne engendrant des macrofilaments dendritiques long de 1,5 mètres dans ces eaux très acides.
Ces communautés sont essentiellement constituées de gð-protéobactéries et de nombreuses að-protéobactéries. Elles sont nettement distinctes des Acidithiobacillus, Leptospirillum et Acidiphilium ainsi que des archées Thermoplasmatales qui dominent dans les eaux de drainage des mines. Il semble que les bactéries des macrofilaments soient hétérotrophes.
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126. Burkholderia cepacia R34 a été isolée pour sa capacité à utiliser le 2,4-dinitrotoluène comme seule source de carbone et d'azote.
Une mutation à saturation de la 2,4-dinitrotoluène dioxygénase (DDO) de la bactérie a permis de substituer une phénylalanine à la valine 350 de la sous-unité að ðde DntAc. Ceci augmente fortement l'activité de l'enzyme sur l'o-nitrophénol, le m-nitrophénol et l'o-méthoxyphénol et élargit le spectre de substrat au m-méthoxyphénol, à l'o-crésol et le m-crésol pour lesquels l'enzyme de départ n'a aucune activité.
Le mutant Val350Met montre également une plus grande activité sur o-nitrophénol et o-méthoxyphénol et s'attaque maintenant à l'o-crésol.
Les produits des variants V350F et V350M ont permis, par ailleurs, de synthétiser de nouveaux produits (méthoxyhydroquinone, méthylhydroqui-none, 2-hydroxybenzyl alcohol et 3-nitrocatéchol). G Brendan et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUN04) 3222-3232
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127. Le toluène est à la fois l'un des vingt premiers produits chimiques par volumes de production et un des polluants majeurs de l'environnement. Plutôt qu polluer on pourrait valoriser les effluents.
Les hydroxylations de composés aromatiques sont des processus métaboliques bactériens fréquents, mais difficiles à réaliser par chimie de synthèse. Y Tao et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUL04) 3814-3820 ont utilisé la toluène 4-monooxygénase (T4MO) de Pseudomonas mendocina KR1 et la toluène 3-monooxygénase (T3MO) de Ralstonia pickettii PKO1 pour convertir le benzène en intermédiaires intéressants de la synthèse chimique. Ils montrent que l'on peut produire phénol (ce qui n'est pas intéressant, car c'est également un polluant majeur), catéchol et 1,2,3-trihydroxybenzène par hydoxylations successives. Il faut donc au moins convertir le benzène en catéchol.
Les catéchols sont des intermédiaires importants pour de nombreuses synthèses. Actuellement, le catéchol est produit par oxydation du phénol ou du m-diisopropylbenzène ou par distillation des goudrons. Tout ceci est peu ragoûtant pour l'environnement.
On avait pu montrer que l'on pouvait faire convertir du glucose par une Escherichia coli exprimant une 3-déhydroshikimate déhydratase et une protocatéchuate décarboxylase ou par oxydation du benzène par une souche de Pseudomonas putida exprimant une toluène/benzène dioxygénase dépourvue de catéchol 1,2-oxygénase et de catéchol 2,3-oxygénase.
Les T4MO et T3MO sont des enzymes à quatre composants qu'il est difficile de modifier du fait de la complexité de la molécule, c'est pourquoi les auteurs ont utilisé les enzymes naturelles
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128.### Le chlorométhane (CH3Cl) est le plus abondant des halocarbones dans l'atmosphère. C'est un contaminant d'origine naturelle (plantes, champignons des pourritures du bois, etc…), mais aussi industrielle, qui est responsable d'environ 17% de la dégradation de la couche d'ozone par des dérivés chlorés. Les sols en sont un puit intéressant, car le chlorométhane y est dégradé par des bactéries méthylotrophes.
C'est le cas de Methylobacterium chloromethanicum, Hyphomicrobium chloromethanicum et Aminobacter IMB-1 et CC495, qui ont été analysées sur le plan métabolique. H. chloromethanicum et Aminobacter IMB-1 et CC495 peuvent également utiliser le bromométhane. Leisingera methylohalidivorans, le seul isolat marin actuellement connu, utilise ces deux substrats, en sus du iodométhane, mais on n'en connait pas les voies métaboliques. C'est à l'élucidation de ces voies par mutagenèse transpositionnelle, qu'E Borodina et al.; Applied & Environmental Microbiology 70 (JUL04) 4177-4186 consacrent leur article.
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129. Les Acinetobacter sont des bactéries du sol qui sont naturellement transformables. On vient de montrer qu'elles sont capables d'acquérir de l'ADN chloroplastique de tabac. J de Vries et al.; Molecular Microbiology 53 (JUL04) 323-334.
Cette acquisition se fait avec une fréquence de 1,2 10-7 par cellule grâce à une recombinaison non homologue, soit 0.1% de la fréquence pour une recombinaison homologue. On constate une fréquence de 44% dans un point chaud du chromosome riche en GC.
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La Politique
130. S Goodman; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 793 souligne l'intérêt de la nouvelle plate-forme de résolution à haut débit de la structure de protéines de Grenoble. Elle pourra, théoriquement s'intéresser à celles des protéines membranaires, jusque là très difficiles à obtenir. L'un des objectifs est, en effet, de résoudre le problème permanent, l'expression des protéines sous une forme cristallisable, puis à les marquer isotopiquement par le deutérium (ce qui est une facilité unique dans le monde). Les organismes existants de détermination de structures, comme l'US Argonne National Laboratory et le synchrotron du RIKEN à Hyogo, ont, jusqu'à présent, cherché à établir le plus vite possible, les structures du plus grand nombre de protéines possibles. On a donc tendance à le faire sur des protéines "faciles".
L'antenne de l'EMBL est étroitement associée à cette initiative, avec l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), la diffraction des neutrons à l'Institut Laue-Langevin (ILL), et l'Institut Français de Biologie structurale (IBS avec ses installations de RMN, spectrométrie de masse et de microscopie électronique.
Cette décision européenne facilitera grandement toute une série de recherches appliquées comme fondamentales. Plusieurs start-ups ont d'ores et déjà été lancées autour de ce dispositif à partir des équipes françaises locales, notamment sur l'expression des protéines avec Protein'eXpert. Il restera à mettre en place un financement à long terme du consortium "Partnership for Structural Biology" mis en place en Décembre 2003. L'Union Européenne a participé au lancement dans le cadre du programme SPINE (Structural Proteomics in Europe) qui finance des postes. Mais le consortium aimerait bien que la Commission participe pour 10% au financement des infrastructures dans les cinq ans à venir. Le reste serait assuré par des initiatives locales et les institutions académiques.
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131. K Sechley; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 803-804 analyse le cas Monsanto contre Schmeiser.
Je rappelle que P Schmeiser aurait délibérément utilisé un colza résistant au glyphosate de Monsanto sans en payer les semences (semences de ferme, procédé facile pour une plante non hybride) enfreignant ainsi le brevet canadien 1 313 830 (23FEB93). Une somptueuse extension au Canada, malgré la décision des autorités de ne pas breveter les plantes et animaux (à la suite du procès Oncomouse et en attendant une décision du Parlement canadien sur le sujet) où Monsanto Canada s'appuie sur le brevet précédent qui ne porte que sur les cellules et séquences nucléotidiques pour couvrir la plante entière, ce qui va de soi en biologie, mais laisse perplexe sur le plan réglementaire. On peut donc protéger, pour l'instant, mais pas breveter des plantes au Canada. Monsanto s'appuie cependant sur un brevet pour protéger
Le 21 Mai la Canadian Supreme Court a confirmé que, malgré l'avis des Federal and Appeal courts, Percy Schmeiser, en cultivant en 1997 et 98 sur ses 1030 acres sans acquitter les droits de 15 dollars canadiens par acre, du colza tolérant le glyphosate, avait enfreint les dispositions légales actuelles.
Les choses sont éminemment compliquées et le verdict s'en ressent. Soit, Schmeiser est coupable d'avoir produit en 1998, dans ses neuf champs, 95 à 98% (ce qui n'est pas rien, et souligne, d'une certaine façon, sa mauvaise foi) de plantes recombinantes Round-Up Ready"!, et ceci a été qualifié de contrefaçon dans le jugement mais, selon la décision du tribunal il n'a pas valorisé son colza mieux qu'un colza ordinaire qu'il n'a, d'ailleurs, jamais qualifié par rapport à la transgenèse. Il n'a donc bénéficié d'aucun avantage commercial qui aurait justifié un dédommagement de Monsanto. L'inventeur a seulement droit à la remise de la portion des profits réalisés par le contrefacteur, qui a un lien de causalité avec l'invention (c'est ce qui ressort de la lecture du jugement : http://www.ecarswell.com/bb/fam_/current/monsanto3.fr.html).
La loi canadienne sur les brevets prévoit deux différents types de réparation: les dommages-intérêts et la remise des profits. Sans profits, pas de remise (Monsanto n'avait pas demandé de dommages et intérêts).
La lecture du jugement bien que rébarbative, est intéressante, car le texte comporte une discussion (en français) sur la notion d'"exploitation" (qui est usuellement plus difficile à démontrer en contrefaçon) et des bénéfices qu'on en tire sciemment ou non, et celle d'"utilisation".
Le fait que Schmeiser n'ait pas, selon ses affirmations, utilisé de glyphosate dans ses champs (mais cependant autour des poteaux téléphoniques et dans les fossés!!!) n'est pas une défense acceptée, car l'avantage du gène de Monsanto est délibérément un avantage latent.
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132. La Chine malgré ses réserves de change considérables (470 milliards de dollars), a toujours cherché à maintenir les importations alimentaires au dessous de 5% des besoins (pour ne pas dépendre de la bienveillance des autres). Le premier ministre Wen Jiabao, a récemment exprimé, devant une assemblée de paysans, son souci de maintenir une production suffisante. The Economist (24JUL04) 48.
Le prix du riz en Chine a augmenté de 18% par rapport au prix mondial (lui-même en hausse de 9,1%) au cours des premiers mois de 2004, indiquant une pénurie menaçante, liée aux problèmes de transport (chroniques dans ce pays où l'armée assure souvent les transports de substances alimentaires, comme j'ai pu le constater à Beijing et dans les provinces), et à une diminution de la production locale. Mais le maintien de l'autosuffisance est difficile faute de terres arables correctes envahies par les villes le long de la côte, manquant d'eau dans le nord du pays, et d'une qualité médiocre dans le sud (terres rouges).
L'augmentation actuelle du prix du riz est un des signaux d'alarme. Cela stimule cependant la production. On devrait récolter cette année 455 millions de tonnes de céréales (512 millions de tonnes en 1998), c'est à dire le niveau d'il y a deux ans, ceci grâce à la montée des prix.
A plus long terme, un prix garanti des céréales vient d'être rétabli, ainsi qu'un contrôle plus strict (mais sera-t-il effectif?) de la conversion des terres agricoles en terrains à bâtir, et les taxes sur les productions agricoles devraient disparaître en cinq ans,. Mais, derrière cette façade, la façon de concevoir l'autosuffisance est en train d'évoluer, avec des importations qui pourraient atteindre 10% des besoins. Il faudrait 37,5 millions de tonnes supplémentaires cette année, dont une partie viendra des réserves et les importations seraient de 8-10 millions de tonnes contre 1 million de tonnes en 2003.
Il faut donc augmenter les rendements et vu ceux prévalents actuellement, il y a encore une marge.
La production a baissé de 16% entre 1999 et 2003 selon les données de l'USDA américain. Le gouvernement a décidé de stimuler fortement la culture des riz génétiquement modifiés (et ceci depuis 2001). Un article de H Jia et al.; Nature Biotechnology 22 (JUN04) 642 analyse cette évolution.
Plusieurs variétés transgéniques sont développées, notamment de résistance à différentes pestes (insectes, champignon et virus). De plus, des variétés résistantes à la salinité et à la sécheresse sont en essai depuis 1998.
Le budget des biotechnologies a été augmenté de quatre fois entre la période 1996-2000 et celle de 2001-2005. Dans le cas du riz, ce sont les essais au champ dont le financement a le plus augmenté. Au moins dix nouveaux essais vont être lancés cette année.
L'une des raisons de la désaffection pour la culture du riz est le coût élevé des engrais et des pesticides qui justifie des cultures plus rentables comme l'aubergine ou les arbres fruitiers, en sus de la migration de 100 millions de paysans vers les villes. L'utilisation de variétés de riz résistantes aux insectes permettrait d'abaisser sensiblement les dépenses en insecticides.
L'Inde va certainement suivre la tendance bien que les pesanteurs administratives soient considérables dans ce domaine.
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134. S Louët; Nature Biotechnology 22 (JUN04) 643  fvÝàw x ’ “ È É é ê ë ì 






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