Les dilutions
Microbiologie générale et appliquée Tome 1 et 2. Leyral .... Les
biocontaminations : cours, TD, TP ... Annales BEP CSS : EP2 (2 tomes : 1 sujet +
1 corrigé).
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= 1,2 L.
La nouvelle concentration est donc C = 0,6 / 1,2 = 0,5 g.L-1
Si on dilue 500 mL d'une solution de 4 mol.L-1 dans 1 litre de diluant, quelle sera la nouvelle concentration ?
La quantité de produit présent est de : n = 0,500 x 4 = 2 moles
Le nouveau volume après dilution est de: 1 L
La nouvelle concentration est donc C = 2 / 1 = 2 mol.L-1
Parfois, la concentration initiale ainsi que la concentration finale désirée sont connues, mais il faut alors trouver la quantité de solvant à ajouter ou le volume initial de solution à diluer pour obtenir cette nouvelle concentration. La formule suivante peut aider à résoudre ce type de problème :
Ci x Vi = Cf x Vf
Ci : concentration initiale disponible (avant dilution)
Vi : volume initial à prélever pour réaliser la dilution
Cf : concentration finale à atteindre après dilution
Vf : volume final total présent (Vf = V diluant + Vi)
Quel volume d'une solution de 0,5 mol.L-1 doit-on prélever afin d'obtenir 500 mL d'une solution de 0,1 mol.L-1 ? Quel est alors le volume de diluant à ajouter ?
Volume initial à prélever : Vi = (Cf x Vf )÷ Ci AN : Vi = (0,1 x 0, 5) ÷ 0,5 = 0,1 L = 100 mL
Volume de diluant à ajouter : V = Vf - Vi V = 500 100 = 400 mL
Vous disposez dun litre d'une solution de 15 g.L-1 à diluer afin dobtenir une solution de 12 g.L-1. Quel volume de diluant devez-vous ajouter ?
Volume final présent : Vf = (Ci x Vi )÷ Cf AN : Vf = (15 x 1) ÷ 12 = 1,25 L
Volume de diluant à ajouter : V = Vf - Vi AN : V = 1,25 - 1 = 0,25 L soit 250 mL
1/ Notions de dilution et facteur de dilution
A travers ces deux derniers exemples, des dilutions de solutions initiales ont été effectuées si bien quaprès dilution les concentrations finales sont plus faibles du fait du volume ajouté. Ces dilutions sexpriment sous forme de fraction d = 1/10 dans la majorité des cas mais elles peuvent également sexprimer en pourcentage (10%) ou sous forme de rapport (1:10).
Ainsi par rapport à la formule précédente pour laquelle
Ci ´ð Vi
Cf = -------------- ; le rapport Vi / Vf correspond à la dilution d, soit Cf = Ci x d
Vf
Cette expression d = 1/10 représente donc le degré de dilution ; en effet le numérateur indique la fraction qu'occupe le volume de solution initiale à diluer et le dénominateur indique la fraction qu'occupe le volume de solution finale, une fois la dilution effectuée. Ainsi, le volume initial représentera 1/10ème du volume final.
De même, la dilution peut s exprimer par un chiffre qui à linverse représente l'augmentation du volume qui résultera de la dilution : Fd.
Ainsi : Fd = 1 / d = Vf / Vi et Ci = Cf x Fd
Calculez dans les deux exemples précédents les dilutions et facteurs de dilutions appliqués.
d = Vi / Vf ; AN : d = 100/500 = 1/5 (Fd = 5) pour le 1er exemple et d = 1/1,25 = 0,8 (Fd = 1,25) pour le 2ème
On rajoute 300 mL de diluant à 200 mL d'une solution initiale. Quel est le facteur de dilution appliqué ? Fd = Vf / Vi ; AN : Fd = (300+200)/200 = 2,5
Quel est le volume de solution à prélever pour produire 1 litre d'une solution diluée au 1/5ème ? Vi = d x Vf ; AN : Vi = 1/5 x 1 = 0,2 L ou 200 mL
Quel sera le volume final d'une solution diluée 2 fois dont le volume est de 150 mL ? Vf = Fd x Vi ; AN : Vf = 2 x 150 ml = 300 mL
Quelle est la concentration finale d'une solution initiale de 2,0 mol.L-1 diluée 1/5ème ? Cf = Ci x d ; Cf = 2,0 x 1/5 = 0,4 mol.L-1
Quelle est la concentration initiale d'une solution de 0,5 mol.L-1 qui a été diluée au ½ ? Ci = Cf / d ; AN : Ci = 0,5 / 0.5 = 1 mol.L-1
Une solution à 1,5 mol.L-1 est diluée pour donner une concentration de 0,3 mol.L-1. Quel est le facteur de dilution appliqué ? Fd = Ci / Cf ; AN : Fd = 1,5 ÷ 0,3 = 5
2/ Notions de dilution en série et de dilution en progression géométrique
Le choix de la réalisation dune dilution unique ou non dépend dun certain nombre de facteurs : volume déchantillon mis à disposition, précision des pipettes, volume de la verrerie pour assurer la dilution
Notamment, lorsquon souhaite réaliser une dilution très grande, un moyen technique pratique pour leffectuer est de réaliser des dilutions en série. Cela consiste à diluer dans un premier temps la solution mère en solution fille (1) et à diluer ensuite cette solution fille (2).
Ainsi : Cf2 = Ci1 x d1 x d2 ou Ci1 = Cf2 x Fd1 x Fd2
d1 et d2 peuvent être différentes.
Néanmoins, certaines expériences nécessitent une solution mère ainsi que la même solution diluée dix fois, une autre diluée cent fois, une autre mille fois, et ainsi de suite. Ce type de dilution, nommée dilution en série également, est produite en prenant la solution mère pour fabriquer une solution diluée dix fois, en prenant ensuite cette dernière solution pour en fabriquer une autre diluée dix fois, et ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la plus petite concentration désirée. On obtient ainsi une série de solutions diluées de 10 en 10, les dilutions sont dans ce cas toutes égales. On parle alors de dilution en progression géométrique de raison 1/10.
Ces dilutions peuvent être réalisées en tubes à essais, à hémolyse mais également en micro-plaque. Lintérêt est ainsi de réaliser des dilutions très grandes en volumes très faibles.
Remarque : une concentration est dautant plus faible que la dilution est grande.
En immunoanalyses , on peut effectuer des dosages semi-quantitatifs des Ac dans un sérum ou des Ag dans un échantillon.
Pour cela, on effectue des dilutions en série de léchantillon antigénique (ou de sérum) sous un volume défini, selon une progression géométrique de base variable X0 et de raison r puis on ajoute un volume constant de sérum (ou de solution antigénique le cas échéant).
Chaque dilution de la série est obtenue en multipliant la dilution précédente par la raison.
La dilution de l Ac ou de l Ag, effectuée avec le diluant est appelée dilution initiale.
Exercices
Analyse semi-quantitative de la bð-lactoglobuline du lactosérum (cf. AT)
Lecture du protocole de l AT
Réalisation du tableau de dilutions après observation du matériel à disposition et notamment des volumes de réactifs.
n° tube123Volume de tampon PBS mðL400400400Volume de L4 mðL100Volume de solution diluée mðL100 100Dilution du L41/51/251/125
Réalisation technique de la gamme de dilution cf. § 3
Recherche de lentérotoxine staphylococcique dans une crème liquide : technique dagglutination passive avec des particules de latex sensibilisées par des Ac anti-entérotoxine
Procéder à une série de dilutions de la crème en micro-plaque, selon une progression géométrique de raison ½ à partir de la dilution 1/10 jusquà la dilution 1/640.
Diluant : tampon PBS qsp 50 mðL par cupule.
Ajouter ensuite 100 mðL de particules de latex par cupule.
Compléter le tableau suivant :
n°cupule1234567Volume tampon mðL90505050505050Volume de crème mðL10Volume de solution diluée mðL505050505050Dilution de la crème1/101/201/401/801/1601/3201/640Volume de particules mðL50505050505050Dilution finale de la crème1/201/401/801/1601/3201/6401/1280
Remarque : parfois, on peut demander à procéder à une série de dilutions en progression géométrique de raison x à partir de la dilution finale y à la dilution finale z . Ne pas oublier dans ce cas de tenir compte de tous les volumes ajoutés dans la cupule. Ainsi, dans lexemple précédent, on aurait pu sarrêter à la cupule 6 afin dobtenir une dilution finale égale à 1/640.
(Ce test ne semble pas être réalisé de manière quantitative étant donné le coût des particules de latex. Il est ceci dit effectué de manière qualitative.)
Recherche dAc anti-Toxoplasma gondii dans un sérum de chat : technique dagglutination active directe
Réactifs : suspension formolée de Toxoplasma gondii (Ag), tampon PBS, sérum de chat.
Réaliser des dilutions en progression géométrique de raison ½ du sérum de chat de la dilution finale ½
à la dilution finale 1/256 sachant que les volumes de diluant et dAg sont chacun de 25 mðL.
Reproduire le tableau de dilutions ci-dessus.
Détermination de la CMI d ampicilline en plaque de microtitration :
Matériel : - plaque de microtitration 96 puits à fond plat, stérile avec couvercle
- Pipette automatique P100 et cônes stériles
- Diluant : bouillon Mueller Hinton
- Inoculum bactérien
- Solution d ampicilline à 2000 mðg.mL-1
1/ Dans une rangée A, effectuer des dilutions successives de raison ½ de la solution d ampicilline jusqu à obtention d une concentration finale d antibiotique de 0.5 mg.L-1, sachant que le volume d inoculum bactérien est constant et de 75 mðL et que le volume finale de la cupule est de 100 mðL.
2/ Préparer une dilution au 1/1,5 de la solution initiale d ampicilline et procéder dans une rangée B ensuite de la même manière que pour la rangée A jusqu à obtention d une concentration finale en antibiotique de 0,3 mg.L-1.
Compléter le tableau suivant :
Cupule
Rangée1234567891011AVolume MH mðL/25252525252525252525Volume
Amp mðL2525252525252525252525Volume
Inoculum mðL7575757575757575757575Cf amp
mg.L-150025012562.531.2515.67.83.91.90.90.5Résultats---------++BVolume MH mðL/25252525252525252525Volume
Amp mðL2525252525252525252525Volume
Inoculum mðL7575757575757575757575Cf amp
mg.L-1333.3166.783.341.720.810.45.22.61.30.60.3Résultats--------+++
La CMI correspond à la concentration minimale inhibitrice c est à dire la concentration dantibiotique la plus petite permettant une absence de croissance bactérienne.
Sachant que le signe + signifie une présence de croissance bactérienne et le signe une absence de croissance, déduire de manière la plus précise possible la CMI de lampicilline testée, à partir des résultats du tableau ci-dessus.
Soit 0.6 < CMI d" 0.9 mg.L-1
3/ Réalisation technique d une dilution en progression géométrique
Il est important de réaliser les étapes suivantes dans l ordre mentionné ci-dessous.
Réaliser votre tableau de gamme de dilutions avant de commencer les manipulations
Annoter vos tubes ou votre plaque soigneusement
Ajouter dans chaque tube un volume constant de diluant
Ajouter dans le 1er tube de la gamme de dilutions le volume de solution antigénique préalablement établi. Procéder par aspiration refoulement (3 fois) pour homogénéiser en plongeant uniquement lextrémité du cône dans le diluant.
Remarque : ne pas faire couler le long de la paroi, se placer juste au-dessus de la solution pour vidanger le cône. Veiller à ne pas faire de bulles. Veiller également à maintenir votre pipette en position strictement verticale.
Sans changer de cône, reprendre dans le tube 1, un volume (préalablement calculé) de solution antigénique, maintenant diluée et le verser dans le tube suivant de la gamme, soit le tube 2, toujours en plaçant lextrémité du cône au-dessus du volume de diluant présent.
Homogénéiser par aspiration refoulement (3 fois).
Reprendre le même volume de solution antigénique (diluée 2 fois) du tube 2 vers le tube 3.
Procéder ainsi jusquau dernier tube de la gamme de dilutions sans jamais changer de cône.
Remarques : - Lors de la préparation des dilutions, il nest pas nécessaire de changer de cône entre chaque tube de dilution, même si on procède de la dilution la plus faible vers la dilution la plus forte. En immunoanalyses, on considère que lerreur sur le volume, apporté par le volume présent sur les bords du cône est négligeable par rapport à lobjectif recherché.
En effet, on ne cherche pas à déterminer une concentration exacte en Ag (comme ce serait le cas en biochimie) mais un titre ou une dilution (dosage semi-quantitatif).
De plus, cette erreur est reproduite dans tous les tubes.
Lors des dépôts, garder le même cône et commencer par la dilution la plus forte.
- en microbiologie, on ne détermine pas non plus de concentration bactérienne précise. Néanmoins, le fait que les bactéries se multiplient de façon exponentielle impose le changement de pipette entre chaque tube de dilutions, auquel cas lerreur serait trop importante.
- dans le dernier tube de la gamme, le volume final est supérieur à celui des autres tubes. Dans un souci de respect de volume final identique dans tous les tubes, il faudrait rejeter un certain volume de solution antigénique. Cependant, la dilution étant tellement grande dans le dernier tube, ce volume ne modifiera pas le résultat et il nest donc pas obligatoire de le rejeter.
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