corrigé - Université de Strasbourg
CORRIGE TD I. Tampon Phosphate pH 7 sans SDS : Etat de charge des
composés : L-DOPA : -CH(NH3+)-COO- donc neutre. CAT et MC neutres. NE, N,
DHBA ...
part of the document
Université de Strasbourg
(U D S)
Ecole européenne de Chimie Polymères et Matériaux de Strasbourg
(E C P M)
Master SA
Notion déchelle dans les méthodes séparatives
NOTION DECHELLE DANS LES METHODES SEPARATIVES
TRAVAUX DIRIGES
I
SEPARATION DE CATECHOLS ET DE CATECHOLAMINES PAR ELECTROPHORESE ET CHROMATOGRAPHIE ELECTROCINETIQUE MICELLAIRE
La figure 1 montre la séparation électrocinétique capillaire dun mélange de catéchols et de catécholamines (voir formules en Annexe) en milieu tampon phosphate, à pH 7. Préciser le mécanisme de cette séparation et interpréter lordre de migration. La durée de lanalyse peut être très sensiblement diminuée en opérant au même pH, mais en milieu borate (figure 2). Lordre de migration est alors profondément modifié. Interpréter, sachant que les ions borate donnent, avec les composés a-hydroxylés, des complexes de la forme :
-- C -- OH - C -- O OH
HBO2 + B + H+
-- C-- OH - C -- O OH
Quelle(s) explication(s) complémentaire(s) fournissent les résultats donnés figure 3 ?
Données :
Concentration micellaire critique du SDS : 8 mM
Indices de Rekker :
- CH3 : 0,702 - CH2 - : 0,530 - CH : 0,235
( al ) - NH2 : - 1,428 ( al ) - NH - : - 1,825
( al ) - OH : - 1,491 ( al ) - CO2H : - 0,954
CORRIGE TD I
Tampon Phosphate pH 7 sans SDS :
Etat de charge des composés :
L-DOPA : -CH(NH3+)-COO- donc neutre
CAT et MC neutres
NE, N, DHBA, DA
Noyau comme CAT + chaine latérale avec amine donc protonée totalement
Charge +1
Tampon avec 20 mM SDS >CMC (8 mM) donc MEKC
Séparation des neutres entre eux par interaction hydrophobes
Micelle anionique donc séparation des chargés +1 par interaction électrostatique et hydrophobe
Incidence de la charge sur lordre de sortie
tm neutre < tm chargé +1
Normal car les chargés +1 interagissent avec les micelles anioniques donc plus retenus
Pour les neutres : Interactions hydrophobes
Séparation suivant lhydrophobie croissante donc indice de Rekker
Log Poctanol/eau = "fi donc décomposer la molécule en différent morceaux
Plus le log P augmente, plus la molécule est hydrophobe.
Partie commune du catéchol log P0
L-DOPA : log P = log P0 + fCH2 + fCH + fCOOH + fNH2
= log P0 + 0,530 + 0,235 0,954 1,428
= log P0 -1,62
CAT : log P = log P0
MC : log P = log P0 + 0,702
NE : log P = log P0 2,15
E : log P = log P0 1,85
DHBA : log P = log P0 0,9
DA : log P = log P0 0,37
Ordre attendu
En résumé, priorité à la charge globale et ensuite hydrophobicité.
Tampon phosphate borate pH 7 avec SDS :
Ordre modifié et tr bien diminuée.
Changement de charge :
Composés 1 4 sont devenus neutre et composés 5 7 chargé négativement
Inversion des familles.
1 4 : Hydrophobie rentre en jeu, plus dinteraction électrostatique.
5 7 : Plus dattraction électrostatique (répulsion avec les micelles donc pas dinclusion)
1 2 3 4 : ordre dhydrophobie (Rekker) donc ordre attendu
5 7 6 : composés chargés, se séparent par différence de mobilité (taille)
Tampon borate pH 7 sans SDS :
On attend :
Absence de séparation des composés neutres 1 4
Séparation des 3 autres comme précédemment (taille)
Séparation 5 7 6 :
On a bien CAT < MC < L-DOPA par différence de taille
Rappel : Mode contre-électroosmotique donc les plus mobiles sont détectés en dernier
Séparation 1 4 :
Ils sont neutres donc ne doivent pas être séparés mais on les distingue un peu.
Complexation non total dans le borate donc amorce de séparation (4 puis 3 puis 2 puis 1).
II
SEPARATION DE PURINES SUBSTITUEES PAR ELECTROPHORESE ET CHROMATOGRAPHIE ELECTROCINETIQUE MICELLAIRE.
La figure 1 représente une séparation électrocinétique de purines substituées dans un tube capillaire en silice fondue de 1 m de longueur et 75 mm de diamètre intérieur. La tension appliquée est de 17,5 kV. L' électrolyte est constitué de Na2HPO4 10 mM, Na2B4O7 6 mM et de SDS 50 mM. L' échantillon est mis en solution dans l' électrolyte et est introduit par électromigration à l' extrémité du capillaire relié au pôle positif. La détection est effectuée par absorptiométrie UV à 280 nm, directement à travers le capillaire, à 90 cm de l' extrémité par laquelle l' échantillon est injecté.
1/. Calculer le pH de lélectrolyte (on remarquera que Na2B4O7 est un mélange dacide borique et de borate de sodium)
2NaBO2 + B2O3 = 2HBO2 H2O
Constantes acido-basiques :
H3PO4 : pk1 = 12,4 ; pk2 = 7,2 ; pk3 = 2,1
HBO2 : pk = 9,2
2/. Dans leau, les purines étudiées ont des propriétés basiques extrêmement faibles et ne sont protonables quen milieu très acide. A l' exception de la cafféine, elles présentent en revanche, suivant les espèces, une ou deux fonctions acides, dont les constantes sont données dans le tableau I.
a/. Etablir, pour un monoacide HA de constante k, puis pour un diacide H2A de constantes k1 et k2, lexpression de la charge apparente en fonction du pH de lélectrolyte. Déterminer la charge apparente au pH de lélectrolyte pour chaque purine.
b/. Interpréter lordre de migration et indiquer le mécanisme de séparation dominant. En quel rang sortirait la caféine en absence de SDS ? Comment peut-on expliquer le comportement du couple acide urique-xanthine ?
PurinesIdentification
(Figure 1)pK1pK2Masse MolaireThéobromineA10-180HypoxanthineB128,9136ThéophylineC8,6-180CafféineD--194Acide uriqueE10,55,5168XanthineF117,5152
CORRIGE TD II
1.
Calcul du pH de lélectrolyte :
On sait que : 2NaBO2 + B2O3 = 2HBO2 H2O
Mélange acido-basique donc leffet tampon vient du Na2H2B207
pH = pKa = 9,21
2.a.
On néglige la protonation des purines dans leau.
Donc deux cas, couple HA/A-, et H2A/HA-/A2-, et cafféine neutre.
Monoacide :
n (charge apparente) = [A-]/([A-]+[HA]) = 1/(1+[HA]/[A-]) = 1/(1+[H+]/k1)
avec k1 = [H+][A-]/[HA]
on peut déterminer n = f(pH)
Diacide :
n = ([HA-]+2[A2-]/([A2-]+[HA-]+[H2A])
comprise entre 0 et 2 car peut être dichargé.
avec k1 = [H+][A2-]/[HA-]
avec k2 = [H+][AH-]/[H2A]
avec k1k2 = [H+]2[A2-]/[H2A]
Donc en multipliant par le rapport [H+]2/[H2A], on obtient :
n = (k2[H+]+2k1k2)/([H+]2+k2[H+]+k1k2)
A : n = 0,14
B : n = 0,67
C : n = 0,8
D : n = 0
E : n = 1,05
F : n = 1,00
2.b.
Ordre de migration :
Les micelles sont anioniques donc chargées négativement
Les composés sont chargés négativement aussi
Donc les micelles ne peuvent pas apporter grand-chose à la séparation.
Séparation électrophorétique suivant la différence de charge et de taille des molécules.
Les masses sont très proches (136 à 180) donc à priori la charge a plus dimportance que la masse.
Pour les composés A, B et C :
A pH 9,2, le composé C est le plus chargé et le composé A le moins chargé (car pk = 8,6)
Donc comme on est en mode contre électroosmotique, les anions sortent du moins mobile au plus mobile
Donc A B C
Composé D :
Neutre donc sort normalement en premier avec le flux EOF, mais il peut être solubilisé dans les micelles et donc sortir avec un temps de rétention. Donc en retard.
Sans SDS, le composé D sort avec le flux EOF.
Composé E F :
Inversion par rapport à la charge apparente (1,05 pour E et 1,00 pour F)
La différence de n est très faible (0,05). Toute approximation a donc une grande importance.
Ceci peut sexpliquer par une approximation sur la valeur des pk.
Du coup, il faut prendre la masse de la mosécule en compte.
E + lourd que F
Donc compromis entre les deux et dans ce cas, cest la masse qui « gagne ».
PAGE 0
PAGE \* MERGEFORMAT 8
Norepinephrine (NE)
Epinephrine (E)
Dopamine (DA)
3,4-Dihydroxybenzylamine (DHBA)°
L-DOPA
Catechol (CAT)
4-Méthylcatechol (4-MC)
"%prv ¯°¶äåçèø · » æ ë ø ÿ ]
d
éÑÊÃÊ·«·«·ÃÊäë¤ÊÊ«vnÊfÊ_Ê_Ê_Ê_Ê_hB&ÍhIúhB&ÍhWf5hB&ÍhWf>*hB&ÍhWf5>*OJQJhB&ÍhúG
5>*CJ$OJQJhB&ÍhWf5>*CJ$OJQJhB&ÍhúG
hB&ÍhWf5OJQJhB&Íh(5OJQJhB&Íh(hB&ÍhWf/jhB&Íh(5OJQJUmHnHtH u+jhB&Íh(5OJQJUmHnHu$$%eopqrstuv°±²³´µ¶åæçù÷ñììììììììììêåÝììììììÛìì$a$gd(gd($a$$@&a$
ÆÓo#çèøùúûüýþÿ v w x ÔðñJKLúøúúúúúúúúúúöðöúööëöööööööö$a$$@&a$$a$
Û
â
ã
å
ç
î
±µ¶ÑÒLMVW¢£±²×Ø
,
.
/
5
9
@
B
C
D
üõîõîõîõÝõÝõÝõÒõÇõ¿µ¿õÒõÒõÒõÒõ¤¤õwphB&Íh×$jhB&Íh×UmHnHtH uhB&ÍhH"±$jhB&ÍhH"±UmHnHtH u jhB&ÍhH"±UmHnHuhB&ÍhWf5>*hB&ÍhWf5hB&ÍhWfCJEHhB&ÍhWfCJEHüÿ jhB&ÍhúG
UmHnHuhB&ÍhIúhB&ÍhWfhg7y&LWXËü,
0
1
2
3
4
5
:
;
<
=
>
?
@
B
D
F
G
H
I
J
üúüúúúúúúúúúúúúúúúúúúúòòòòòò$a$gdH"±@&D
E
Q
R
`
v
±
²
³
¸
¹
-`d£Ó234u¢£¥¶ÑÒ&4BDJtv¨ª²¸Àïèáè×Ð×èÈÀèÀè¸è¸è±è±è¥¡¡¡|thfAh>7
H* h>7
H*hfAhfAH*hfAhfA5hfAhfA>*hfAhÙÐhB&ÍhB&ÍhB&Í>*h×hB&ÍhB&ÍhB&Íh×5hÙÐh×H*hÙÐh×H*hRJ5>*hB&Íh×5>*hB&ÍhWfhB&Íh× jhB&Íh×UmHnHu-J
K
L
M
N
O
P
Q
_
`
¡
¢
Æ
Ø
è
.89ef¤23L÷÷÷÷÷÷÷÷÷ïïïïïïïïïïïïïïïïïï$a$gd×$a$gdH"±LM¤¥ÑÒ(*¾À24z|ä"8U{¡Ééab÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷ï÷÷÷÷÷÷÷÷÷$a$gdqu$a$gd×ÀÄÌÔÜâ018STqr ¡ÀÁáâbjluÑÒi{þ¢³,`agÅÆÉÊÔÕÖ×ØÙ#$÷ó÷ó÷ó÷óëóçëçëçëçóçëçëçëçÝÖÝÖÝçÒçÒÈÖÈÒÀÒÀ»Ò·Ò°©©©©©©hB&ÍhihB&ÍhWfCJEHüÿhB&ÍhWfhB&Íh×h`@á hRJ>*hRJhRJ>*hquhRJ5>*hRJhRJ5>*hquhqu5>*hquhquhquH*hfAhfAhfAH*:b°±ÉÊ-.uÒÓhiÈüýþ÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷ï÷÷÷ää÷÷÷÷$
&Fa$gdRJ$a$gdRJ$a$gd×KL¡¢µ¶abcdefjkÐÑÒ#$&'()÷÷÷÷ï÷÷÷÷ççççççââààÛÛÛÛÛÛ$a$$a$$a$gdH"±$a$gdRJ$a$gd×$%AYfgj|}~±¸¿ÀÄÅÆÇÎÏÓÔÖõöøùþÿ#$=B ¥ª«¼½ÂÃÅÑþ5Bjq5YZ]^mnoíæßØßØßÍßÍßÍßØßØÉÁÉÁÉÁÉÁÉÁÉßÍßÍßÍßÍßÍßÍßØßØßÍßÍßÍßØßØßØßØ߸®¸®¸§¸hB&Íh%jhB&ÍhiCJH*hB&ÍhiCJhBb×hBb×H*hBb×hB&ÍhWfCJEHüÿhB&ÍhÙÐhB&ÍhWfhB&Íhi$jhB&ÍhiUmHnHtH uA)*+,-./0123456789:;?@A¹ºÖ×úúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúòú$a$gdBb×$a$×ó23]`WX2345=LW[_múúúúúúúúúøøøåååååå$$&`#$/Ifa$gd4$a$mnopqrE2222$$&`#$/Ifa$gd4ºkd$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4rst
ì2ìììºkdï$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4$$&`#$/Ifa$gd4ost
¡¢¥¦§²³´µ¸¹º»¾¿ÀÈÉÊËÌÍÎÏÒÓÔàáâãçèëìïðñùúûüþÿôíäÛÏôÏôÏôÏôíäÛÏôÏôÏôÏôíäÛÏôÏôÏôÏôíäÛÏôÏôÏôÏôíäÛÏôÏôÏôÏôíäÛÏôÏôÏôÏôíȼhB&ÍhWf5>*CJ$hB&ÍhWfhB&Íh45CJ\hB&ÍhiCJhB&Íh4CJhB&Íh%jhB&Íhi5CJ\F
ìì2ììºkdÐ$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4$$&`#$/Ifa$gd4¢¦§³ììì2ìºkd±$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4$$&`#$/Ifa$gd4³µ¹»¿Àìììì2ºkd$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4$$&`#$/Ifa$gd4ÀÉËÍÏÓììììì$$&`#$/Ifa$gd4ÓÔáãèìE2222$$&`#$/Ifa$gd4ºkds$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4ìðñúüÿì2ìììºkdT$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4$$&`#$/Ifa$gd4ÿ
ìì200ºkd5$$IfFÖÖrÿÁ\#-ÀóÒ
t
6`Ö0ÿÿööÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿÖÿÿÿÿÿ4Ö4Ö
laöyt4$$&`#$/Ifa$gd4
!$%FGqr¯°ÀÁÇÈúû< = I J ýýýýýýøðøøøøøøøøøøøøøøøøøøø$a$gdÏ+gdÏ+ !"#$CEFGZ[_`abijnopq§¨©ª«¬®¯°¿ÀÂÄÇÈ ! " $ & ; < = F c d i j öïëïöäàëØàäÑàÉàÉàÉàÉàÉàëàÉàÉàÉàÉäÑàëàÅàÅà½àÉà½à½àäëµ±©±©±©±¤± hH*hhH*hhh>*hBb×hBb×H*h÷GahBb×hBb×H*hBb×hÏ+hBb×hBb×>*hBb×hBb×hBb×hÏ+hB&ÍhÏ+hÏ+hÏ+5>*= ¡ ¢ ¥ ¦ Ì Ó Ø à á ã ä æ è í ï ô õ ù ú þ !+!,!-!3!4!9!:!=!?!D!E!N!O!T!U!Y!Z!^!_!c!i!j!k!l!q!r!s!t!v!÷ó÷óîóæóÞó×Ï×È×Ï×Ï×Ï×À×ȼ×Èó÷óîóîóæó·óîóîó÷ó¬ ¬ ¬¬¬hhH*mH sH h_JhH*mH sH h_JhH*mH sH h_JhmH sH hH*hß+hß+hH*hß+hß+hß+hH*hß+hhh>*hhH* hH*hhhH*5J ® Ë Ì × Ø þ ,!-!H!c!!!À!Á!è!é!ö!"""&"3"8"9"O"úúúúúúúúúúúúúúúúúõõõõõõõõúúúgd_Jgdv!x!|!}!!§!¨!©!ª!!®!°!¿!À!Á!Å!Ç!È!Ê!Ë!Ï!Ð!Ñ!Ò!×!Ø!Ù!Ú!Ü!Ý!ß!à!ã!ä!å!æ!è!é!õ!ö!""""""%"&"2"3"óèÜèÕÍÕÍÕÅÕÁ½Á²ªªªªªªªªªªªh¸%cmH sH hmH sH hh_JH*mH sH hh_JH*mH sH h_JmH sH hh_JmH sH hh_Jh_Jh_JH*h_Jh_JH*h_Jh_Jh_Jh_JH*mH sH h_JhmH sH h_JhH*mH sH 1O"P""µ"ü"ý"W#X#»#¼#Ú#Û#4$5$$©$ª$¶$·$[%\%%%%%å%æ%D&&Ã&úúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúgd3"{"""È"ú"û"ü"W#X#m#t#¼#×#ª$³$%% &C&^&
&&'' '!'"'#'$'&''')'*','-'/'0'7'8'9':'='>'U'V'W'X'['\']'_'`'b'c'e'f'üøüøüøüøüøôøìøìøìøôøôøôüôüäÝÕÑÕÑÕÑÕÑÉÅɼÉÅÉÅɳÉÅѨŠÅÅj¦hUjæ+hUjAhUjh(hUhg7ymHnHuhmHnHuhjhUhD+jhD+UhB&ÍhWfhB&ÍhWf5hv]hv]>*hwDhv]h÷Ga8Ã&Ó&' '!'"'#'%'&'(')'+','.'/';'